膿毒癥患者外周血微小RNA-155和CD4+CD25+Treg細胞表達水平及意義

沈業周 余嬌陽 周飛 張儉

(杭州師范大學附屬醫院重癥醫學科，浙江 杭州 310015)

膿毒癥主要是由感染所致的一種全身炎癥反應綜合征，具有病情兇險、病死率高等特點，發展為膿毒癥休克和嚴重膿毒癥，嚴重威脅人們生命安全及影響生活質量〔1,2〕。因此，早期、準確及快速診斷可改善膿毒癥患者預后，具有重要意義〔3〕。微小RNA作為廣泛存在于生物體內的高度保守的短小RNA，與多種疾病發生、生理和病理過程關系緊密。研究顯示，膿毒癥外周血中微小RNA能夠在一定程度上反映機體炎癥情況，且可判定疾病嚴重程度〔4〕。膿毒癥患者可發生嚴重的免疫功能紊亂，同時也是引起膿毒癥患者死亡的重要原因。CD4+CD25+Treg細胞是新發現的一種負向免疫調節細胞，其可經多途徑影響機體的免疫狀態〔5〕。本研究探討膿毒癥患者外周血微小RNA-155和CD4+CD25+Treg的表達水平及意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選自2016年3月至2017年12月杭州師范大學附屬醫院接受診治的膿毒癥患者80例作為研究對象。納入標準：①經臨床指征、生物標志物和微生物學檢查等確診；②患者臨床資料完整；③獲得知情同意，簽訂知情同意書。排除標準：①風濕免疫系疾病、器官移植術后者；②慢性器官衰竭或障礙、血液系統疾病者；③精神疾病者；④惡性腫瘤者。納入的80例膿毒癥患者，男47例，女33例；年齡60～79〔平均(69.83±6.57)〕歲；根據患者病情程度分為膿毒癥組62例，膿毒癥休克組18例。膿毒癥組男38例，女24例，平均年齡〔(69.17±5.89)〕歲；膿毒癥休克組男9例，女9例，平均年齡(70.43±6.74)歲，另選擇同期健康體檢者60例作為對照組，男37例，女23例；年齡60～78〔平均(69.34±7.53)〕歲。膿毒癥組、膿毒癥休克組與對照組性別、年齡比較差異無統計學意義(χ2=0.792，P<0.05;t=1.402，P<0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1外周血標本采集 所有研究對象于入院當天抽取外周靜脈血4 ml，肝素抗凝，分置于兩管中，每管2 ml，分別用于微小RNA-155表達和CD4+CD25+Treg細胞表達檢測。

1.2.2微小RNA-155表達檢測 采用TRIzol一步法提取總RNA，嚴格依據美國Invitrogen公司TRIzol試劑盒標準操作。采用紫外分光光度計測定總RNA的吸光度值。引物合成由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：上游引物：5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，下游引物：5′-GCAGGGTCCGAGGT-3′。在熒光定量PCR儀進行RT-PCR。反應總體積為25 μl。反應條件：95℃15 min預變性，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共35個循環。采用2-△△Ct法計算微小RNA-155相對表達量。

1.2.3CD4+CD25+Treg細胞表達檢測 取抗凝全血加入試管中，分別加入5 μl的CD25-FITC和CD4-PE單抗，充分混勻后放置于室溫條件下避光反應15 min，加入溶血劑500 μl，放置于37℃下10 min，完全溶血后上美國Beckman-Coulter公司流式細胞儀檢測CD25強陽性的CD4+CD25+Treg表達。

1.3觀察指標 ①觀察兩組氧合指數和血乳酸水平變化；②觀察各組急性生理學及慢性健康狀況評分系統(APACHE Ⅱ)評分和序貫器官功能障礙評分(SOFA)變化；③觀察各組外周血微小RNA-155表達；④觀察各組外周血CD4+CD25+Treg細胞表達。

1.4統計學方法 運用SPSS22.0軟件進行t、F及χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組氧合指數和血乳酸水平比較 膿毒癥組和膿毒癥休克組氧合指數明顯低于對照組而血乳酸水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；膿毒癥休克組氧合指數明顯低于膿毒癥組而血乳酸水平明顯高于膿毒癥組，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組氧合指數和血乳酸水平比較

與膿毒癥組比較:1)P<0.05；與對照組比較:2)P<0.05，下表同

2.2各組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較 膿毒癥組和膿毒癥休克組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；膿毒癥休克組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分明顯高于膿毒癥組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較分)

2.3各組微小RNA-155相對表達量比較 膿毒癥組和膿毒癥休克組微小RNA-155相對表達量(1.15±0.21、1.52±0.17)高于對照組(0.64±0.15)，差異有統計學意義(均P<0.05)；膿毒癥休克組微小RNA-155相對表達量明顯高于膿毒癥組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4各組CD4+CD25+Treg細胞表達比較 膿毒癥組和膿毒癥休克組CD4+CD25+Treg細胞表達水平明顯〔(1.54±0.38)%、(3.67±1.78)%〕明顯高于對照組〔(0.41±0.12)%〕，差異有統計學意義(P<0.05)；膿毒癥休克組CD4+CD25+Treg細胞表達水平明顯高于膿毒癥組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

膿毒癥是感染、休克、燒傷、創傷等危急重患者的嚴重并發癥之一，同時也是誘發多器官障礙綜合征、感染中毒性休克的重要因素〔6～8〕。由于膿毒癥病情進展迅速、病死率高，給臨床工作造成很大困難〔9～12〕。 微小RNA在參與炎性疾病病理生理過程、維持機體自身穩態等方面具有重要效應，其微小RNA-155是近年來學者研究熱點之一，被認為是膿毒癥炎癥網絡效應的平衡點參與病理生理過程，可作為膿毒癥早期診斷的敏感指標之一，同時也可能是今后膿毒癥接受基因治療和免疫調理的重要靶點〔13，14〕。相關研究報道表明，體內微小RNA-155表達與膿毒癥免疫失衡程度存在相關性，從而提高膿毒癥病死率，并且對膿毒癥病情嚴重程度具有一定預警作用〔15〕。本文研究表明，膿毒癥組和膿毒癥休克組微小RNA-155表達增高，且隨著病情的發展升高越明顯，但其具體作用機制尚未完全闡明，還需后續繼續深入研究，提供可靠的參考價值。

學者認為膿毒癥的本質主要是機體對細菌感染出現的過度反應，病原體及其毒素導致炎癥損害以及機體免疫功能狀態具有重要作用〔16，17〕。CD4+CD25+Treg最早在小鼠體內發現，能夠特異性地表達CD25，是負向免疫調控的一類細胞，具有廣泛的免疫抑制效應，同時還影響機體的獲得性免疫和天然免疫，如介導Th1/Th2漂移，調節抗炎與促炎介質水平從而影響免疫細胞如中性粒細胞、T細胞和單核巨噬細胞的凋亡和增殖。CD4+CD25+Treg在膿毒癥輔助的免疫調節網絡中主要發揮對細胞免疫的抑制作用〔18〕。當膿毒癥時機體主要表現為CD4+CD25+Treg水平持續上升，加劇免疫無反應狀態。臨床上通過對CD4+CD25+Treg檢測能夠為了解膿毒癥患者免疫狀態對患者臨床治療和預后具有重要意義〔19〕。本文研究表明，膿毒癥組和膿毒癥休克組CD4+CD25+Treg細胞表達增高，且隨著病情的發展升高越明顯。膿毒癥患者病情加重，發生細胞免疫低下可能與CD4+CD25+Treg上升有因果關系，認為其機制可能是由于CD4+CD25+Treg通過導致抗炎細胞因子如細胞白介素(IL)-10和轉化生長因子(TGF)-β的升高，抑制淋巴細胞增殖，引起T淋巴細胞彼此殺傷，使T細胞總數及活化的T細胞數量下降。綜上所述，膿毒癥患者外周血微小RNA-155和CD4+CD25+Treg呈高表達，且與病情進展密切相關，有助于診斷和指導治療。