鹽酸氫嗎啡酮降低缺血再灌注大鼠心肌損傷

董文理 張郃 廖衛寧 程金紅 安寧

(咸寧市中心醫院麻醉科，湖北 咸寧 437000)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指心肌組織在經歷一定時間的缺血后恢復血流供應，心肌損傷加重的一種現象。其可導致代謝異常、心律失常、心肌舒縮功能障礙等，導致心臟發生一系列損傷，目前缺血性心臟病已成為世界范圍內引起死亡的一個主要病癥〔1〕。鹽酸氫嗎啡酮是一種新型的強效阿片類鎮痛藥，具有良好的血流動力學穩定性，可同時保證足夠的心肌氧供應，靜脈給藥后5～8 min就能發揮最大的藥效〔2〕。關于鹽酸氫嗎啡酮對心肌缺血后處理的保護效應研究較少，有研究顯示，氫嗎啡酮可減輕大鼠MIRI，其保護機制可能與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/內皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號的激活有關〔3〕。氫嗎啡酮后處理可通過改善再灌注左室功能、降低心肌損傷相關酶濃度、增加冠脈流量、降低心肌梗死面積，從而減輕大鼠MIRI，其心肌保護作用與抑制線粒體膜轉運孔在灌注初期開放有關〔4〕。本研究旨在探討鹽酸氫嗎啡酮對MIRI后炎性因子、心肌梗死面積、Toll樣受體(TLR)-4 信號及凋亡相關蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 鹽酸氫嗎啡酮注射液由湖北宜昌人福藥業有限公司生產。2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)、烏拉坦、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自美國Sigma；TLR-4、Bcl-2、Bax和酶切caspase3抗體均購自美國CST。蛋白質凝膠成像系統購自美國Bio-rad。

1.2實驗分組及處理 健康SPF級雄性成年SD大鼠108只，體重180～220 g，于23℃、50%濕度條件下飼養。采用隨機數字表法分為假手術(S)組、缺血再灌注(I/R)組和鹽酸氫嗎啡酮預先給藥(H)組，每組36只，其中S組只分離股動脈及頸內靜脈，不作其他處理。H組在缺血前10 min頸內靜脈注射鹽酸氫嗎啡酮注射液0.2 mg/kg。I/R組頸內靜脈注射等容量生理鹽水。

1.3肢體I/R致大鼠心肌損傷模型建立 大鼠禁食8 h，不禁飲，腹腔注射25%烏拉坦5 ml/kg麻醉，右頸部開口分離頸內靜脈，置管建立靜脈輸液系統，接微電腦靜脈微量輸液泵。后肢游離雙側股動脈、股靜脈，動脈夾夾閉股動脈近端，并用張力帶股鞘下環扎阻斷側支循環。遠端股動脈置管測壓，血壓為0標志缺血成功，肢體缺血2 h，去除動脈夾恢復肢體血供，血壓升高為再灌注成功。

1.4生化指標的測定 于再灌注120 min末隨機取6只采集動脈血樣，4℃，離心10 min，取上清液，-80℃冰箱保存待測。采用ELISA測定血清白細胞介素(IL)-6、IL-10、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)濃度。步驟見ELISA試劑盒說明。

1.5心肌梗死面積測定 于再灌注120 min末，即實驗結束后取下離體灌流的心臟，將心房及動脈剪取，保留心室，濾紙吸干稱重，于-30℃冰箱冷凍15 min，取出變硬的心臟，將心室從心尖向心底方向剪成1 mm的薄片，共6片，37℃、避光、1%TTC溶液浸泡15 min，取出薄片，正常區呈現磚紅色，而梗死區呈現灰白色，將梗死區心肌剪下，濾紙吸干稱重。梗死面積(IS)=梗死區重量/心室重量×100%。

1.6心肌組織中TLR-4、Bcl-2、Bax和酶切caspase3蛋白水平檢測 于再灌注120 min末取出心肌后，4℃預冷生理鹽水沖洗，剝取約50 mg心肌組織，放射免疫沉淀(RIPA)裂解液適量提取組織總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)測定蛋白濃度，以4∶1比例，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5 min，取變性蛋白30 μg，每孔道等量，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，分離后的蛋白經電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，膜用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加TLR-4、Bcl-2、Bax和酶切caspase3抗體，抗體的工作液濃度均為1∶1 000，4℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜，電化學發光(ECL)顯色，顯影、定影。應用Image-Pro Plus軟件分析。以GAPDH為內參，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值比值為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1血清IL-6、IL-10、SOD和MDA濃度 與S組比較，I/R組IL-6、IL-10和MDA的濃度均明顯升高，SOD濃度明顯降低(P<0.05)；與I/R組比較，H組IL-6和MDA濃度均明顯降低，IL-10和SOD濃度明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.2心肌梗死面積 與S組(9.8%±1.7%)比較，I/R組心肌梗死面積(66.1%±5.6%)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，H組心肌梗死面積(30.4%±3.5%)顯著降低(P<0.05)。

表1 各組血清IL-6、IL-10、SOD和MAD濃度

與S組比較，2)與I/R組比較：P<0.05；表2同

2.3心肌組織TLR-4蛋白表達 與S組(0.078±0.010)比較，I/R組TLR-4蛋白表達(0.802±0.075)顯著增加(P<0.05)；與I/R組，H組TLR-4蛋白表達(0.214±0.018)顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組心肌組織TLR-4蛋白表達

2.4心肌組織凋亡相關蛋白表達 與S組比較，I/R組Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax和酶切caspase3的蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，H組Bcl-2的蛋白表達顯著升高，Bax和酶切caspase3的蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表2和圖2。

表2 各組Bcl-2、Bax和酶切caspase3蛋白的相對表達量

圖2 各組心肌組織凋亡相關蛋白表達

3 討 論

離體心臟試驗發現多種藥物和生物因子具有與藥物預處理有關的心肌保護作用，如異氟烷、胰島素、轉化生長因子-β、粒細胞集落刺激因子、腺苷受體激動劑、他汀類等〔5～7〕。嗎啡等阿片類藥物在動物離體心肌缺血再灌注損傷的實驗中亦顯示出藥物預處理的心肌保護作用。以往對阿片類藥物預處理的心肌保護作用的實驗研究多在細胞和離體心臟模型水平進行，如嗎啡預處理可通過調控miR-133b-5p減輕心肌細胞缺氧再給氧損傷〔8〕；舒芬太尼后處理可能通過上調Bcl-2表達，下調Bax表達，抑制細胞凋亡，從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷〔9〕。而在體水平上應用阿片類藥物預處理是否仍具有心肌保護作用，尚待進一步研究。鹽酸氫嗎啡酮是一種新型的強效阿片類鎮痛藥，是否具有心肌缺血后處理的保護效應尚未明確。本研究結果顯示，鹽酸氫嗎啡酮可提高大鼠MIRI后血清IL-10和SOD濃度，降低IL-6和MDA濃度，降低心肌梗死面積，降低TLR-4 信號，促進Bcl-2表達，抑制Bax和酶切caspase3表達。

心肌炎、心力衰竭、膿毒癥、心臟再灌注損傷等多種心血管疾病均與細胞因子的釋放有關〔10〕。IL-6是一種具有多種生物活性的因子，由中性粒細胞產生，參與免疫調節及應激反應，有研究表明，缺血及再灌注可誘導心肌細胞產生IL-6〔11〕。IL-10是體內主要的抗炎因子之一，主要由T淋巴細胞和單核細胞產生，可抑制Th1細胞分泌IL-6、腫瘤壞死因子-α等細胞因子〔12〕。氧化應激被認為是I/R引起心肌損傷的一個重要機制，自由基是氧化應激造成MIRI的主要參與者，其反應程度與SOD和MDA有關〔13〕。本研究結果提示，鹽酸氫嗎啡酮可通過調節炎性因子IL-6、IL-10、SOD和MDA濃度減輕MIRI。

TLRs作為一類介導天然免疫反應的跨膜信號轉導受體家族，能夠識別特定類型微生物保守的分子成分，引發一系列信號轉導，進而導致炎性介質釋放，在天然免疫防御中起重要作用，并可最終激活獲得性免疫系統〔14〕。目前已在哺乳動物中發現至少有12 種Toll 蛋白，其中TLR-4信號通路在MIRI中發揮重要作用，TLR-4突變后能減弱其后信號轉導從而減輕MIRI及炎癥反應〔15〕。細胞凋亡又稱為程序性死亡，是心肌梗死早期細胞死亡的一個主要形式，最后可導致MIRI。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，有研究表明，Bcl-2和Bax的實際濃度在I/R過程中發揮保護或促進細胞凋亡的作用〔16〕。caspase3屬于caspase家族成員，是細胞凋亡過程中的效應caspase及凋亡的執行者，其活化將使凋亡進入不可逆階段〔17〕。川陳皮素后處理可通過Bcl-2、Bax和caspase3表達調節減輕MIRI細胞凋亡〔18〕。本研究結果提示鹽酸氫嗎啡酮對MIRI心肌細胞凋亡影響可能與調節Bcl-2、Bax和caspase3表達有關。

綜上，鹽酸氫嗎啡酮可通過對炎性因子IL-6、IL-10、MDA和SOD，心肌梗死面積，TLR-4 信號及凋亡相關的Bcl-2、Bax和酶切caspase3表達的調節，從而對MIRI起保護作用。