不同發酵條件對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響

鄭曉雅，殷偉偉，張 松，蘭 瑛

（1.華南師范大學生命科學學院，廣東 廣州 510631；2.深圳市匯尚科科技有限公司，廣東 深圳 518055）

【研究意義】食用菌多糖是由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的天然高分子聚合物，可從食藥用真菌子實體、菌絲體、發酵液中分離得到，是一種具有多種功能的活性多糖［1-3］。柱狀田頭菇（Agrocybe aegerita）又稱為茶薪菇，隸屬真菌門擔子菌綱糞銹傘科田菇屬［4-5］，是集多糖、氨基酸、菌蛋白等多種營養物質及保健食療于一身的食用菌，其蓋嫩柄脆、口感鮮美，可用于烹制各類佳肴，營養成分高，屬高檔食用菌類。柱狀田頭菇還具有極高的藥用價值［6-7］，有研究表明，柱狀田頭菇因含有蛋白質、多糖、維生素、生物堿等成分，具有多種重要的生理功能，如抑菌［8］、抗腫瘤［9-10］、抗氧化及延緩衰老［11-12］。其中，多糖是柱狀田頭菇中最重要的活性成分之一，具有抗氧化、減少肝損傷及提高免疫活性等作用［13-14］。由于食藥用菌的固體培養耗時長，從子實體中提取多糖周期較長且較難實現連續化生產。而液體發酵生產周期短，可連續生產，且在發酵液中產生多糖、多肽等多種生理活性物質，類似于子實體的營養成分。因此，利用液體發酵法生產提取制備柱狀田頭菇多糖是實現其工業化生產的重要途徑和方法。【前人研究進展】目前對柱狀田頭菇的液體發酵研究主要集中于對其菌絲體生物量的研究。劉明等［15］以菌絲體生物量為指標，篩選到適合茶樹菇液體培養的培養基為豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%，最適培養溫度為26 ℃，適宜起始pH值為6.5；劉敏等［16］以菌絲體為指標，得到最適宜的培養基配方為葡萄糖3.0%、豆餅粉1.0%、酵母膏 0.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.10%， 培養條件為起始pH 6～7、培養溫度25～28 ℃、搖床轉速150～180 r/min。【本研究切入點】目前對柱狀田頭菇液體培養產胞外多糖條件的優化研究較少，且已有研究中所用豆餅粉等培養基成分較為復雜，無法保證從發酵液中提取的胞外多糖純度。【擬解決的關鍵問題】本文研究了柱狀田頭菇液體發酵培養基中的碳、氮源及其濃度以及發酵條件對柱狀田頭菇產胞外多糖的影響，并根據胞外多糖產量優化得到適宜的發酵條件，旨在提高柱狀田頭菇的胞外多糖產量，為柱狀田頭菇進一步的開發利用及其多糖工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：柱狀田頭菇菌株，由華南師范大學生命科學學院提供。

培養基配方：（1）平板菌種培養基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，（NH4）2SO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO41 g，瓊脂20g，加水定容至1 000 mL，pH值調至6.5。（2）液體發酵的基礎培養基配方：葡萄糖20 g，硝酸鈉2 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl30.2 g，ZnCl20.1 g，MnSO40.1 g，維生素B10.1 g，Na2HPO41 g，CaCl20.01g，營養液20 mL，加水定容至1 000 mL，pH值調至6.5。其營養液配方：CaCl21.00 g，AlK（SO4）20.01 g，CuSO40.01 g，Na2MoO4·2H2O 0.01 g，H3BO30.01 g，加水定容至1 000 mL。

儀器設備：AB204-N電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TH-A3560C高壓滅菌鍋（造鑫企業有限公司）；ZHJH-1109超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；雙層大容量全溫度恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；SHZ-D（III）循環水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；RE-52D旋轉蒸發儀（上海市青浦滬西儀器廠）；UV1700紫外-可見光分光儀（日本島津公司）；H.H.S水浴鍋（上海浦東榮豐科學儀器公司）；DL-101-2烘箱（天津市申環實驗電爐有限公司）。

1.2 試驗方法

按基礎培養基配方，轉速為180 r/min，培養時間為8 d，進行以下培養條件優化實驗。

1.2.1 液體發酵適宜起始pH值篩選 將液體培養基配方用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調節起始pH 值為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，研究不同起始pH值對產胞外多糖的影響。

1.2.2 液體發酵適宜碳源篩選 用篩選出的起始pH值，分別采用葡萄糖、甘露醇、乳糖、可溶性淀粉、果糖和蔗糖代替基礎培養基中的碳源，使培養基中碳元素含量為600 mmol/L，觀察不同碳源對產胞外多糖的影響。

1.2.3 液體發酵適宜氮源篩選 用篩選出的起始pH值和碳源，以蛋白胨、NaNO2、NH4NO3、（NH4）2SO4、尿素、L-甲硫氨酸和L-谷氨酰胺代替基礎培養基中的氮源，使培養基中氮元素含量為20 mmol/L，觀察不同氮源對產胞外多糖的影響，篩選出培養基的最適氮源。

1.2.4 液體發酵適宜碳源濃度篩選 用篩選出的起始pH值、碳源、氮源，分別設定碳源濃度為1、5、20、40、100 g/L，探究不同濃度碳源對產胞外多糖的影響。

1.2.5 液體發酵適宜氮源濃度篩選 用篩選出的起始pH值、碳源及濃度、氮源，分別設定氮源濃度為0.1、0.5、2、5、20 g/L，探究不同濃度氮源對產胞外多糖的影響。

1.2.6 液體發酵適宜轉速篩選 用篩選出的起始pH值和碳、氮源及其濃度，分別將搖床轉速設置為100、150、180、200、250 r/min，觀察不同轉速對產胞外多糖的影響，篩選出液體發酵的適宜轉速。

1.2.7 液體發酵適宜培養時間篩選 用篩選出的起始pH值、碳氮源及其濃度、轉速，進行不同培養時間的選擇試驗，從試驗第4天開始取樣測定發酵液中胞外多糖產量，每隔2 d取樣測定1次，試驗持續16 d，觀察不同發酵時間對產胞外多糖的影響，篩選出液體發酵的最適培養時間。

上述試驗均按培養基配方制備培養液，將100 mL培養液裝入250 mL三角瓶，除了含有甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的培養基采用微孔濾膜及針頭式過濾器過濾除菌外，其余培養基高壓滅菌（121℃）35 min備用。將菌株轉接于平板培養基的培養皿內，制成平板菌種，用同一打孔器（直徑為4 mm）在平板菌種的同一半徑上打孔，將等量菌栓接入培養基，置于ZHWY-2102型振蕩培養箱，在26 ℃、轉速180 r/min下避光恒溫振蕩培養。采用隨機分組設計，3次重復。

1.3 測定指標及方法

多糖產量測定：發酵液經旋轉蒸發儀濃縮后去蛋白、脫色、醇沉、透析及冷凍干燥，得到胞外多糖。采用苯酚-硫酸法［17］測定總糖含量，計算其相對于葡萄糖的換算因子f：

f=m/ρ0D0

式中，m為多糖質量（μg），ρ0為多糖液中葡萄糖的質量濃度，D0為多糖的稀釋因數［18］。

多糖產量=ρ×D×f

式中，ρ為樣品溶液中葡萄糖含量，D為樣品溶液的稀釋倍數，f為換算因子。

所有數據采用SPSS 21.0進行統計，采用Duncan法進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 不同起始pH值對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響

發酵液起始pH值的變化直接影響食用菌菌絲體細胞內pH值的變化，間接影響到細胞內酶的活性，pH值過高或過低都會對某些酶的活性起到抑制作用，從而使菌絲代謝減緩，影響菌絲生長，進而影響菌絲產胞外多糖。一般認為，pH值對酶活性的影響是通過細胞內H+或OH-影響酶蛋白的電荷和解離度，而改變酶的結構和功能來實現的［19］。不同起始pH值對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響見圖1，柱狀田頭菇在pH值4.0～10.0范圍內均可生長，且在該范圍內均可產生胞外多糖，含量總體都比較平穩，其中pH值7.0時，胞外多糖產量最高、平均產量達0.7244 g/L，故可將柱狀田頭菇液體發酵起始pH值選定為7.0。

圖1 不同起始pH值對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響Fig.1 Effects of different initial pH values on the extracellular polysaccharides produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.2 不同碳源對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響

碳源是微生物生長繁殖所需的營養物質，在細胞中起著重要作用。碳源主要用于供應菌株生命活動所需要的能量，構成菌體細胞及代謝產物，是食藥用菌液體培養的主要營養成分［20］。不同碳源對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響見圖2，柱狀田頭菇在含6種不同碳源的培養基中都能生長并分泌胞外多糖，說明柱狀田頭菇菌絲可利用多種碳源。以可溶性淀粉為碳源時胞外多糖產量最高、達1.395 g/L，極顯著高于其他碳源；以甘露醇為碳源時多糖產量較低、僅為0.117 g/L。因此，柱狀田頭菇菌絲合成和分泌胞外多糖的適宜碳源是可溶性淀粉。

圖2 不同碳源對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.3 不同氮源對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響

氮源主要用于構成菌體細胞物質和含氮代謝物，也是食藥用菌液體培養的主要營養成分［21］。不同氮源對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響見圖3，從圖3可以看出，有機氮源和無機氮源均可被柱狀田頭菇菌絲體吸收、利用進而產胞外多糖。以L-谷氨酰胺作為氮源時柱狀田頭菇液體發酵產胞外多糖最高、達1.018 g/L，其次是硝酸銨、亞硝酸鈉和蛋白胨，三者之間無顯著差異。

圖3 不同氮源對柱狀田頭菇產胞外多糖的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.4 不同濃度可溶性淀粉對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響

碳源濃度影響著菌絲體生長的速度和胞外多糖的產量，不同濃度可溶性淀粉對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響見圖4。圖4顯示，在1～40 g/L濃度范圍內，隨著可溶性淀粉濃度的增加，胞外多糖產量逐漸增加，可溶性淀粉濃度達到40 g/L時胞外多糖產量最大、為1.183 g/L。但是，胞外多糖產量在可溶性淀粉濃度為20 g/L和40 g/L時差異不顯著。當淀粉濃度高于40 g/L時，隨著濃度升高，胞外多糖產量下降。因此，淀粉濃度對柱狀田頭菇的胞外多糖產量影響較大，當濃度較低時胞外多糖產量較低，濃度過高則會抑制菌絲體生長進而影響胞外多糖的產生。因此，可將柱狀田頭菇液體發酵的可溶性淀粉濃度調控在20～40 g/L之間。

圖4 不同濃度可溶性淀粉對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響Fig.4 Effect of different concentrations of soluble starch on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.5 不同濃度L-谷氨酰胺對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響

不同濃度L-谷氨酰胺對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響見圖5，在2 g/L濃度范圍內，隨著氮源濃度的提高，胞外多糖產量逐漸增加。當氮源濃度為2 g/L時，胞外多糖產量達最高、為1.360 g/L，極顯著高于其他濃度處理；當氮源濃度大于2 g/L時，胞外多糖產量隨氮源濃度的升高反而下降。因此，2 g/L為柱狀田頭菇液體發酵時L-谷氨酰胺的適宜濃度。

圖5 不同濃度L-谷氨酰胺對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響Fig.5 Effects of different concentrations of L-Glutamine on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.6 不同轉速對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響

搖床轉速與發酵液中的溶氧水平密切相關，限制著菌絲的生長、長勢、營養物質利用率、營養成分轉化等，轉速過高和過低都不利于菌絲體發酵產糖［22］。不同轉速對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響見圖6，圖6顯示，當搖床轉速為100 r/min時，胞外多糖產量較低；隨著搖床轉速升高至180 r/min時，胞外多糖產量達到最大值、為0.804 g/L，與其他轉速處理的胞外多糖產量相比達到極顯著差異；當搖床轉速大于180 r/min時，胞外多糖產量急劇下降。因此，柱狀田頭菇液體發酵的適宜轉速是180 r/min。

圖6 不同轉速對柱狀田頭菇產胞外多糖的影響Fig.6 Effects of different shaking speed on the extracellular polysaccharide produced by myceliaof Agrocybe aegerita

2.7 不同發酵時間對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響

圖7 不同發酵時間對柱狀田頭菇菌絲產胞外多糖的影響Fig.7 Effects of different culture time on the extracellular polysaccharides produced by mycelia of Agrocybe aegerita

由圖7可知，胞外多糖在4～8 d內分泌緩慢，隨著菌絲的不斷生長而大量合成并分泌多糖，培養到第12天時胞外多糖產量最高，與在其他培養時間處理的胞外多糖產量差異極顯著，而后隨著培養時間的延長，胞外多糖產量下降。因此，柱狀田頭菇菌絲體液體發酵產胞外多糖適宜的培養時間為12 d。

3 討論

在食用菌的液體培養中，pH值是重要的影響因素之一。劉敏等［16］以菌絲體為檢測指標對茶樹菇液體發酵條件進行探究，得到其液體發酵最適初始pH值為6.0～7.0。陳少英［23］以多糖產量為指標，得到茶樹菇液體發酵最適pH值為5.6，而鄧超等［24］的研究結果則是保持pH值為自然狀態。本研究發現柱狀田頭菇液體培養產胞外多糖的最適起始pH值為7.0，從結果可知柱狀田頭菇可在中性及偏微酸的環境下生長，且培養基成分的不同可能影響起始pH值的確定。

前人對桑黃、樟芝等真菌進行液體培養基條件的研究表明，碳源分別為蔗糖和葡萄糖、氮源分別為氯化銨和酵母浸粉時，胞外多糖產量最高，并發現不同種類真菌對碳源、氮源的要求不同［25-26］。陳少英和鄧超等探究了茶樹菇液體發酵產胞外多糖的碳氮源條件，得出最適碳源為小麥粉和玉米粉、最適氮源為酵母浸膏和酵母粉［23-24］。本研究中，柱狀田頭菇在多種碳源中均可生長并分泌多糖，說明其可利用多種碳源，其中以可溶性淀粉為碳源時胞外多糖產量最高，其次分別為蔗糖、葡萄糖、乳糖和果糖，且均沒有顯著差異。對于氮源來說，本試驗中以L-谷氨酰胺為氮源時胞外多糖產量最高，其次是硝酸銨、蛋白胨和亞硝酸鈉。本研究結果與前人研究結果有較大不同，造成差異的原因可能是前人研究選擇的碳氮源均為純天然來源的有機碳源和氮源，成分較為復雜，可能會對從發酵液中提取的胞外多糖產量產生干擾；而本試驗中均選擇結構確定的化合物作為碳氮源，導致結果存在一定差異。

此外，在食用菌液體發酵過程中，營養物質濃度過低不能滿足菌絲生長的需要，濃度過高則會抑制菌絲生長［27］，因此培養基C/N是一個很重要的參考指標，而適宜的碳源和氮源物質更容易被菌絲分解利用［28］。在適宜的碳氮比條件下，適宜的碳源物質和氮源物質可使菌絲生長良好，影響真菌多糖和脂類的產生和合成［29］。陳群等［30］結果表明，C/N為60時，柱狀田頭菇菌絲體多糖產量最高，而鄧超等［24］研究表明C/N約為6.7時柱狀田頭菇的多糖產量最高，陳少英［23］結果更低、C/N為2∶1。本研究通過對柱狀田頭菇碳源、氮源濃度的探究，選定C/N在10∶1～20∶1之間，產多糖較多。這與前人研究結果不同且差異很大，可能是與碳、氮源的濃度和種類有關，利用不同來源的碳源及氮源時，其最適濃度也會不一樣。

溶氧是發酵中的另一個重要因素，通過調整搖床轉速來控制溶氧量［31］，為菌絲體生長創造適宜環境，可提高胞外多糖的產量。有研究表明，搖床轉速為150 r/min時多糖產量最高［23-24］。劉敏等［16］研究表明，搖床轉速為150～180 r/min時，茶樹菇菌絲體生長最好。本研究中轉速為180 r/min時菌絲生長最好、胞外多糖產量最高，說明搖床轉速可能是通過影響菌絲球的生長來影響胞外多糖產量。此外，液體發酵周期一般為5～10 d，在此周期內菌絲球生長直徑良好、密度高，有利于菌絲產胞外多糖。李炳功等［32］研究發現液體發酵灰樹花14 d時多糖產量最高，王儲炎等［33］研究發現液體培養黑芝菌6 d時胞外多糖產量最高，本研究中培養時間為12 d時柱狀田頭菇胞外多糖產量較高，說明不同菌種之間培養時間存在較大差異。

4 結論

本研究確定了柱狀田頭菇的適宜碳源是可溶性淀粉，其適宜濃度為20～40 g/L；適宜氮源是L-谷氨酰胺，濃度為2 g/L；最適起始pH值為7.0，搖床轉速為180 r/min，于26 ℃下培養12 d。在該發酵條件下，柱狀田頭菇的胞外多糖產量較高、為1.08 g/L，其中多糖含量為71.73%、蛋白質含量為8.62%。研究結果為利用液體發酵工業化生產柱狀田頭菇多糖提供了理論依據。