三七總皂苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)血管單元的影響*

林 軍，梁 萍，黃 清，李 沖，農(nóng)立宇，黃建敏，李雪斌，蒙蘭青

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

三七總皂苷（PNS）是我國名貴中藥三七的有效活性成分，治療腦梗死的臨床療效明顯[1]。局灶性腦缺血時(shí)，神經(jīng)血管單元（NVU）中的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和微血管均受到損傷[2]，因此缺血性腦損傷是多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑的損傷，尋求對(duì)腦缺血損傷后有整合作用的藥物很有意義。本研究中建立了大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察大鼠缺血灶周邊腦組織NVU超微結(jié)構(gòu)及相關(guān)的神經(jīng)核抗原（NeuN）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和層粘連蛋白（LN）在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化，以探討PNS對(duì)腦缺血后NVU的影響，闡明PNS在腦缺血治療中的整合作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：SD雄性大鼠144只，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～300 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（桂）2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（桂）2011-0010。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

儀器與試藥：H-7650型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司）。三七總皂苷[注射用血栓通（凍干），廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20025652，批號(hào)為15090707，規(guī)格為每支100 mg、150 mg、250 mg]。戊二醛固定液（電鏡專用，2.5%），4%多聚甲醛（北京 Solarbio公司）；RIPA裂解液，BCA蛋白定量（增強(qiáng)型）試劑均購于碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗NeuN抗體、兔抗GFAP抗體、兔抗betaActin抗體均購于武漢Proteintech公司；兔抗Anti-Laminin抗體（ab11575，美國 Abcam 公司）。

1.2 方法

分組與給藥：將144只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和治療組，各48只；各組又分別按腦缺血再灌注后 24 h、72 h、7 d、3周分為 4個(gè)亞組，各 12只。治療組大鼠在術(shù)后4 h神經(jīng)功能評(píng)分后即給予三七總皂苷50 mg/kg腹腔注射，之后每日1次，直到相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)；模型組和假手術(shù)組大鼠在相同時(shí)間點(diǎn)給予同體積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。

局灶性大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型制作：模型組和治療組大鼠參考文獻(xiàn)[3]線栓法并加以改良，制作局灶性MCAO模型。假手術(shù)組栓線頭插頸內(nèi)動(dòng)脈深度為8～10mm，未造成缺血。

神經(jīng)功能評(píng)分：術(shù)后3～4 h大鼠基本蘇醒，應(yīng)用Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[3]，1～3分為制模成功。隨之各組進(jìn)行干預(yù)，分別在缺血再灌注后24 h、72 h、7 d、3周時(shí)對(duì)3組中各亞組12只模型大鼠再次進(jìn)行評(píng)分。

蛋白免疫印跡法（WB）標(biāo)本采集及檢測(cè)：分別在缺血再灌注后24 h、72 h、7 d、3周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，各組隨機(jī)取6只大鼠，腹腔麻醉，斷頭取腦，于冰上剪取缺血灶周邊相應(yīng)位置腦組織，剪碎，置含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中研磨勻漿，4℃下13 000 r/min離心5 min，取上清液，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。各組取20 μg蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將電泳后的蛋白電轉(zhuǎn)于PVDF膜上，封閉液封閉60 min，按適當(dāng)比例將各個(gè)一抗與一抗稀釋液稀釋[NeuN抗體 1∶500～1∶5 000，GFAP抗體 1∶500～1∶5000，Anti-Laminin抗體（ab11575）1∶200～1∶1000，β-actin抗體 1∶1 000～1∶10 000]，4℃孵育過夜，TBST洗膜后，將膜與HRP-山羊抗兔二抗（二抗用稀釋液按照1∶5 000比例稀釋）室溫?fù)u床孵育1.5 h，然后TBST洗滌，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影、定影，利用Image J軟件分析條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白（NeuN，GFAP，LN）與內(nèi)參蛋白β-actin二者灰度值的比值。

電鏡標(biāo)本采集及檢測(cè)：取3組剩余大鼠，腹腔麻醉，開胸，充分暴露心臟，從左心室向升主動(dòng)脈插入灌注針，剪破右心耳，放靜脈血，快速灌注100 mL生理鹽水，大鼠肝臟變白，右心房流出液清亮?xí)r即可換預(yù)冷的4%多聚甲醛200 mL灌注，大鼠后肢繃直，尾巴豎起，表明固定成功。斷頭取腦，分別從右側(cè)缺血灶周邊腦組織相應(yīng)部位各取組織塊，切成約1 mm×1 mm×1 mm小塊，放入2.5%戊二醛固定液，于4℃避光固定24 h。按常規(guī)電鏡檢測(cè)標(biāo)本制備程序逐步進(jìn)行，漂洗、脫水、浸透及環(huán)氧樹脂包埋。超薄切片，片厚約50 nm，切片醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，采用H-7650型透射電鏡下觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)變化并進(jìn)行攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

結(jié)果見表1?？梢?，干預(yù)前（即術(shù)后4 h）治療組和模型組神經(jīng)功能評(píng)分比較無明顯差異（P＞0.05）；干預(yù)后治療組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分逐漸改善，比同時(shí)間點(diǎn)模型組明顯降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（± s，分，n=12）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（± s，分，n=12）

注：與模型組24 h亞組比較，△P＞0.05；與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，▲P＜0.05。

組別24 h亞組 72 h亞組 7 d亞組 3周亞組假手術(shù)組模型組治療組干預(yù)前0 2.00±0.60 1.92±0.63 24 h干預(yù)后0 2.00±0.60 1.83±0.65△干預(yù)前0 1.83±0.65 1.83±0.65 72 h干預(yù)后0 1.92±0.63 1.08±0.36▲干預(yù)前0 1.92±0.63 1.92±0.63 7 d干預(yù)后0 1.50±0.43 0.92±0.36▲干預(yù)前0 2.00±0.60 2.00±0.60 3周干預(yù)后0 1.33±0.39 0.71±0.26▲

2.2 蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

NeuN蛋白：模型組各時(shí)間點(diǎn)NeuN蛋白表達(dá)均低于假手術(shù)組，其中24 h、7 d、3周表達(dá)相對(duì)于假手術(shù)組差異顯著（P＜0.05）；相比模型組，治療組NeuN的表達(dá)量逐漸升高，在IR 72 h后基本接近正常，7 d、3周表達(dá)差異顯著（P＜0.05）。詳見圖1 A及圖2 A。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織灰度值比較（± s，n=6）

GFAP蛋白：GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)量，模型組逐漸增加，各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均低于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組相比，治療組各時(shí)間點(diǎn)較模型組升高，其中72 h、7 d、3周表達(dá)差異顯著（P＜0.05），至 IR 7 d后，治療組GFAP蛋白表達(dá)基本接近正常。詳見圖1 B及圖2 B。

LN蛋白：模型組LN蛋白表達(dá)量逐漸增加，各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)仍低于假手術(shù)組，24 h、72 h、7 d相比假手術(shù)組差異顯著（P＜0.05）；治療組各時(shí)間點(diǎn)LN蛋白表達(dá)量較模型組高，其中7 d、3周與模型組相比差異顯著（P＜0.05）。詳見圖1 C及圖2 C。

2.3 大鼠腦缺血灶周邊NVU超微結(jié)構(gòu)變化

神經(jīng)元：見圖3 A。各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組神經(jīng)元無變化，胞核大，圓形或橢圓形，核仁清晰可見，著色深，多位于中央，染色質(zhì)均勻分布，核膜清晰完整；細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整；胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)正常。隨時(shí)間的延長，模型組神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)不同程度的破壞，胞核變形、伴有切跡甚至破裂皺縮，核仁邊聚或消失，核膜有模糊或斷裂，細(xì)胞器開始腫脹伴空泡狀，有溶解空白區(qū)，甚至結(jié)構(gòu)疏松減少。治療組神經(jīng)元胞核形態(tài)尚可、核膜完整不斷裂、核仁大部分可見，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)狀態(tài)好于模型組同時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)。

膠質(zhì)細(xì)胞：各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組膠質(zhì)細(xì)胞無改變，輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整，胞核呈卵圓形，核膜正常，染色質(zhì)分布均勻，染色略深，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常、清晰。隨時(shí)間的延長，模型組膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有不同程度的破壞，胞核不同形狀變形，染色質(zhì)大部分邊聚多見，核膜72 h開始模糊不清，細(xì)胞器可見空泡狀或空白區(qū)、有溶解甚至結(jié)構(gòu)破壞疏松。治療組膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)優(yōu)于模型組、核膜完整清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)狀態(tài)好于模型組同時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)。詳見圖3 B。

微血管：各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組微血管無變化，周圍無水腫，間隙致密無擴(kuò)大，管壁光滑，管腔正常，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，基底膜連續(xù)、薄厚均勻。模型組微血管內(nèi)皮細(xì)胞逐漸出現(xiàn)變形甚至有空泡，管腔不同程度狹窄，血管周圍不同程度溶解伴水腫、72 h較明顯，可見空泡狀或空白區(qū)。治療組微血管內(nèi)皮細(xì)胞變形不明顯、管腔基本通暢、管周水腫較模型組減輕，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)狀態(tài)好于模型組同時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)。詳見圖3 C。

3 討論

目前，對(duì)腦損傷的研究焦點(diǎn)逐漸從單一的神經(jīng)元轉(zhuǎn)向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和微血管等組成的復(fù)合體，即NVU。該概念于2002年由美國神經(jīng)疾病與卒中研究所首次提出[4]，強(qiáng)調(diào)NVU中三者間相互聯(lián)系、相互作用的重要性。NVU各成分之間存在復(fù)雜的信號(hào)偶聯(lián)和傳遞，任何一組分的破壞都會(huì)影響到NVU的整體功能[5]。局灶性腦缺血時(shí)，不僅是神經(jīng)元受損害，提供神經(jīng)元氧和能量的微血管及起支持功能的膠質(zhì)細(xì)胞也同時(shí)受到損傷[2]，對(duì)缺血性腦損傷的研究應(yīng)把神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和微血管視為整體進(jìn)行研究。腦缺血涉及多種不同類型細(xì)胞的功能障礙，單純對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)或單個(gè)靶點(diǎn)治療難以達(dá)到充分的保護(hù)效果[6]，因此神經(jīng)保護(hù)治療的目標(biāo)應(yīng)是同時(shí)對(duì)NVU中膠質(zhì)細(xì)胞、微血管的整體保護(hù)。

三七總皂苷對(duì)腦缺血具有多靶點(diǎn)、多方位作用。ZHOU等[7]發(fā)現(xiàn)，PNS可通過抗氧化降低大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡。徐士欣等[8]發(fā)現(xiàn)，PNS能對(duì)腦缺血再灌注損傷早期發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，可能與顯著抑制血腦屏障破壞相關(guān)的蛋白表達(dá)水平有關(guān)，為PNS干預(yù)腦缺血后對(duì)血腦屏障損傷起一定保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。PNS通過抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)腦缺血治療后能促進(jìn)神經(jīng)元形態(tài)恢復(fù)和數(shù)量增加[9]。PNS可通過干預(yù)腦缺血性損傷的多個(gè)級(jí)聯(lián)病理反應(yīng)，從而防護(hù)腦缺血性損傷。

圖3 各組大鼠神經(jīng)元血管單元電鏡下超微結(jié)構(gòu)

NeuN被認(rèn)為是成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物，其蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，可反映神經(jīng)細(xì)胞成熟程度[10]。SHARP等[11]選用沙鼠短暫性腦缺血模型來研究海馬、齒狀回部位新生成的細(xì)胞，通過BrdU標(biāo)記新生成的分裂細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腦缺血后1個(gè)月有2/3的細(xì)胞表達(dá)出現(xiàn)成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物NeuN，表明腦缺血后內(nèi)源性的神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞被增殖分化，從而進(jìn)行修復(fù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能重塑。本試驗(yàn)中經(jīng)PNS干預(yù)后NeuN的表達(dá)量逐漸升高，同時(shí)電鏡觀察到神經(jīng)元形態(tài)學(xué)較模型組損傷減輕，考慮是NeuN對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能起到修復(fù)、重塑作用的結(jié)果，表明PNS能保護(hù)神經(jīng)元存活，可能與上調(diào)NeuN蛋白表達(dá)有關(guān)。

GFAP被認(rèn)為是活化狀態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的標(biāo)志物[12]。GOMES等[13]的研究表明，上調(diào) GFAP表達(dá)水平可促進(jìn)腦組織損傷的修復(fù)，提示GFAP可能有誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦缺血損傷起修復(fù)作用。本研究結(jié)果顯示，PNS可上調(diào)腦缺血后GFAP蛋白表達(dá)，電鏡觀察到膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)好于模型組，核膜完整清晰，說明GFAP可對(duì)缺血損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道大致相符，提示PNS可能與上調(diào)GFAP蛋白表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

LN是檢測(cè)血管基底膜完整性的敏感指標(biāo)，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、黏附，促進(jìn)血管新生的作用[14]。本研究中治療組LN的表達(dá)量較模型組逐漸升高，電鏡觀察到微血管管周水腫較模型組逐漸減輕，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)狀態(tài)好于模型組同時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)，表明了LN增多能促進(jìn)血管新生，對(duì)微血管起到修復(fù)作用，與施浩[14]的研究結(jié)果大致相似，提示PNS可能與上調(diào)LN表達(dá)起微血管修復(fù)作用。

腦缺血后可導(dǎo)致NVU損傷，主要表現(xiàn)在NVU結(jié)構(gòu)完整性的改變。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化是反映細(xì)胞損傷程度甚至死亡最直觀的指標(biāo)[15]。HAN等[16]在大鼠腦缺血再灌注模型研究中選擇電鏡技術(shù)能細(xì)微地觀察到腦損傷后神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及微血管三者的超微結(jié)構(gòu)變化。通過透射電子顯微鏡不僅同時(shí)觀察到大鼠腦缺血后NVU的神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、血管基底膜及血管周邊的膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的完整性破壞，發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞損傷的同時(shí)伴隨著線粒體嵴的腫脹破壞，血管損傷性水腫[17]。利用電鏡技術(shù)對(duì)阿爾茨海默病的老年患者腦組織中神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及毛細(xì)血管觀測(cè)，不僅能清晰觀察到三者同時(shí)出現(xiàn)細(xì)微結(jié)構(gòu)改變，也發(fā)現(xiàn)血管壁與鄰近神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間在功能和形態(tài)上有著相互作用[18]。因此，電鏡不僅可同時(shí)觀察NVU中三者的細(xì)微形態(tài)結(jié)構(gòu)，還能觀察NVU各組分間相互關(guān)聯(lián)的病理形態(tài)學(xué)改變。提示電鏡技術(shù)是目前觀察和研究NVU超微結(jié)構(gòu)最直接、最客觀的方法。

本研究選用電鏡同時(shí)觀察腦缺血后NVU中神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和微血管的動(dòng)態(tài)超微病理形態(tài)改變的研究，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。電鏡結(jié)果顯示，與模型組相比，各PNS治療組大鼠腦細(xì)胞神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和微血管的病理形態(tài)改變均有所改善，提示PNS能同時(shí)減輕腦缺血再灌注后NVU的病理形態(tài)改變，這與文獻(xiàn)[19]報(bào)道結(jié)果大致符合；治療組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分與模型組相比逐漸改善，神經(jīng)功能缺失癥狀也逐漸減輕，有臨床研究表明，神經(jīng)功能的缺失是最直接的評(píng)價(jià)腦梗死后神經(jīng)損傷輕重的指標(biāo)[20]，說明PNS干預(yù)后可改善腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，減輕腦缺血后損傷。神經(jīng)功能評(píng)分和病理形態(tài)學(xué)是評(píng)價(jià)藥物抗腦缺血效應(yīng)的指標(biāo)[19]，表明三七總皂苷可通過整合促進(jìn)腦缺血后NVU神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和微血管的修復(fù)，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用。