大蒜素改善糖尿病心肌病大鼠心功能及纖維化的作用及對NF-κB信號通路的影響

陸曉丹，宗剛軍，周建英，張麗君

（中國人民解放軍第101醫院·江南大學附屬醫院，江蘇 無錫 214000）

糖尿病性心肌病被定義為心肌的結構和功能異常，與冠狀動脈疾病或高血壓無關。其調控機制涉及氧化應激、神經激素激活、炎癥、鈣穩態受損、線粒體損傷、心肌細胞凋亡和自噬[1]。Toll樣受體（TLR）為先天免疫反應的識別受體，可通過損傷相關分子模式激活，TLR亞型TLR4在心臟中廣泛表達，TLR4參與心肌炎的調節，并在缺氧缺血性心臟損傷、肥大型心臟病損傷中起關鍵作用[2]。核因子 -κB（NF- κB）是調節胚胎免疫、細胞凋亡、血管生成、發育和增殖的主要轉錄因子，并可通過TLR4激活。NF-κB介導多種炎性介質的基因表達，如細胞間黏附分子-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素6[3]。NF-κB與心臟內的免疫和應激反應密切相關[4]。大蒜素是大蒜的活性成分，具有抗氧化、抗炎、神經保護、抗菌和抗腫瘤作用；在阿霉素誘導的大鼠心臟毒性模型中，大蒜素降低心肌組織中的一氧化氮水平，并通過降低血清白細胞介素1β（IL-1β）和TNF-α水平顯示出抗炎作用，同時可抑制NF-κB的蛋白表達或核轉位[5]。此外，大蒜素可通過降低PI3K/Akt通路的活化，對心肌肥厚和纖維化具有保護作用。本研究中擬探討大蒜素改善糖尿病心肌病大鼠心功能及纖維化的作用及對NF-κB信號通路的影響，為糖尿病心肌病的治療提供理論參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

清潔級SD大鼠100只，12周齡，體質量（119.54±12.34）g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，合格證號為 SCXK（桂）2014-0002。自由攝取飼料、自由飲水，自動控制晝夜循環（12 h/12 h，光照 7：00 ～19：00），室溫（22±1）℃。試驗嚴格按照《中華人民共和國實驗動物管理條例》《實驗動物質量管理方法》進行。

大蒜素注射液（正大天晴集團股份有限公司，國藥準字H32025640，規格為每支5 mL∶6 mg），根據成人劑量公式換算，大鼠用藥量為成人的20.13倍，以10.0mL/kg體質量灌胃，得藥液濃度為10.0 g/mL。戊四氮（純度99.99%，Sigma公司），TLR4、NF- κB ELISA 試劑盒（上海邦奕生物科技有限公司）；TLR4，NF-κB一抗、二抗（武漢伊艾博科技有限公司）；DAB顯色試劑盒（博士德生物工程有限公司）。熱電MK3型酶標儀（美國熱電）。

1.2 分組與給藥

根據大鼠體質量隨機分成對照組（A組），模型組（B組），大蒜素低劑量組（C1組，10.0 mg/kg）、中劑量組（C2組，20.0 mg/kg）、高劑量組（C3組，40.0 mg/kg），每組20只，雌雄各半。B組、大蒜素各劑量組大鼠禁食12 h，腹腔1次性注射鏈脲佐菌素（65 μg/g），7 d后空腹測血糖，血糖大于16.7 mmol/L且出現糖尿病癥狀（多飲、多食、多尿），說明建模成功。高脂飼料喂養3個月，誘導糖尿病心臟損傷，期間大蒜素各劑量組腹腔灌胃給予相應藥物，A組和B組給予等體積生理鹽水。試驗結束后，采用脈沖多普勒檢測各組大鼠心功能指標，包括左室舒張早期最大血流/二尖瓣心房收縮期最大血流（E/A）、左室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）。

1.3 檢測指標與方法

心肌病變：采用三色（MASSON）染色法觀察各組鼠心肌纖維化程度。

TLR4及 NF-кB mRNA 水平（qRT-PCR 法）：使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Germany）從所有組織樣品中分離總 RNA。使用 Reverse Transcription試劑盒（Applied Biosystem，USA）通過PCR擴增通過逆轉錄合成互補DNA（cDNA）；使用 Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystem，USA）和用于 TLR4及 NF-κB 的特異性引物在 Lightcycler 96系統（Roche，USA）上進行qRT-PCR。TLR4 正向引物 5′-CTATCGAAGGGACCTAG-3′，反向引物 5′-ACCTACTTCAGCAGGCCTCG-3′；NF-κB 正向引物 5′-CTTCTGGGGACTTCT-3′，反向引物 5′-CTAGTTTCAGCAGGCTTGTC-3′（產品規格均為150 bp）。β-肌動蛋白用作內部對照，引物序列為正向 5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′反向5′AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′（產物大小 179 bp）。每份樣品的qRT-PCR反應一式3份進行。TLR4，NF-κB的qRT-PCR熱曲線為94℃ 10 min、94℃ 30 s、58℃ 35 s、72℃ 1 min；45個循環。通過相對基因定量方法（2-ΔΔCT方法）計算 mRNA倍數變化。

TLR4，NF-κB，IL-2，IL-6，TNF-α 水平（ELISA法）：按照無菌條件操作，稱取0.1 g心肌組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將心肌碾碎至粉末狀；將組織粉末轉入 2 mL Eppendorf管中，加入 1.2 mL PBS（pH 7.4），充分振蕩混勻，2 000 g，4 ℃，離心 20 min。仔細收集上清液。獲取心肌組織勻漿后，采用Elisa法檢測心肌中 TLR4，NF-κB，IL-2，IL-6，TNF-α 蛋白水平。

TLR4及NF-κB蛋白表達水平：通過使用TLR4，NF-κB兔多克隆抗體和抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記的二級抗體，在4 μm石蠟包埋的組織切片上進行TLR4及NF-κB蛋白表達的檢測。使用3%過氧化氫溶液和蛋白質阻斷試劑來終止蛋白質的酶活性和非特異性結合。組織切片的抗原修復在Tris EDTA緩沖液（pH 9.0）中進行。用二氨基聯苯胺（DAB）底物和Mayer′s蘇木精復染物檢測陽性染色。以高放大倍數（40×）觀察500個細胞。在至少5個視野中使用半定量方法對染色的組織切片進行評分。染色標準為0表示 ＜5%陽性染色細胞（陰性表達）；+1表示5% ～20%陽性染色細胞（弱表達）；+2表示21% ～50%陽性染色細胞（中度表達）；+3表示＞50%陽性染色細胞（強表達）。

1.4 統計學處理

采用SPSS19.0統計學軟件處理。計量資料以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α為0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心功能指標

由表1可見，與A組比較，大蒜素各劑量組EA，LVEF，FS降低（P＜0.05）；與 B組比較，大蒜素各劑量組 EA，LVEF，FS升高（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加，EA，LVEF，FS逐漸升高，量效關系明顯（P＜0.05）。

2.2 心肌細胞結構

由圖1可見，A組心肌細胞完整，結構正常，染色清晰，核呈卵圓形位于中央膠，在心肌間質及血管周圍見少量亮綠色膠原纖維；B組可見大量肥大、壞死心肌細胞，排列紊亂，且細胞脫失現象明顯，細胞核固縮，心肌纖維化明顯，綠色膠原纖維明顯增加；C3組見少量壞死、肥大心肌細胞，綠色膠原纖維較B組明顯減少；C1及C2組較B組壞死心肌細胞減少，但綠色膠原纖維依然明顯存在，具有明顯的劑量依賴效應。

圖1 大蒜素對大鼠各檢測指標的影響（400×）

2.3 TLR4，NF-κB mRNA 表達水平

由表1可見，與A組比較，大蒜素各劑量組TLR4及NF-κB mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與B組比較，大蒜素各劑量組TLR4及NF-κB mRNA表達水平降低（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加而逐漸降低，量效關系明顯（P＜0.05）。

表1 各組檢測指標水平比較（± s，n=20）

表1 各組檢測指標水平比較（± s，n=20）

注：與 A 組比較，*P ＜0.05；與 B 組比較，#P ＜0.05；與 C3組比較，□P ＜0.03。

組別劑量（mg/kg）基因表達 蛋白表達（ng/g） 炎性因子蛋白表達（ng/g）A組B組C1組C2組C3組10 20 40 EA 2.23±0.21 1.39±0.20*1.50±0.19*#1.78±0.20*#2.06±0.18*#心功能指標LVEF（%）79.23±2.09 62.24±3.98*65.99±2.03*#70.35±3.26*#76.19±2.79*#FS（% ）58.16±1.02 39.48±5.87*45.14±1.65*#51.29±2.49*#56.34±2.36*#TLR4 mRNA 0.85±0.35 3.58±0.48*3.00±0.28*#2.45±0.54*#1.34±0.28*#NF-κB mRNA 0.78±0.15 2.85±0.34*2.36±0.34*#1.65±0.39*#1.24±0.29*#TLR4 98.54±15.21 268.21±15.21*243.54±14.21*#190.47±11.25*#86.54±12.47*#NF-κB 90.24±910.23 251.36±12.36*234.12±15.21*#189.28±14.19*#134.44±12.763*#IL-2 78.98±16.32 326.21±19.69 261.36±15.32*#□196.32±18.32*#□171.32±24.36*#IL-6 123.65±23.21 413.65±13.69 302.67±19.32*#□203.36±17.32*#□160.68±36.69*#TNF-α 99.36±18.63 589.36±18.34 432.39±15.39*#□269.25±19.99*#□1 393.26±26.39*#

2.4 TLR4及NF-κB蛋白表達水平

由表1可見，與A組比較，大蒜素各劑量組TLR4及 NF-κB蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與 B組比較，大蒜素各劑量組TLR4及NF-κB蛋白表達水平降低（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加而逐漸降低，量效關系明顯（P＜0.05）。免疫組化法下，TLR4及NF-κB陽性表達為棕褐色，TLR4及NF-κB陽性表達情況與各蛋白表達水平符合。

2.5 IL-2，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平

由表1可見，與A組比較，大蒜素各劑量組IL-2，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與 B 組比較，大蒜素各劑量組IL-2，IL-6，TNF-α蛋白表達水平降低（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加而逐漸降低，量效關系明顯（P＜0.05）。

3 討論

糖尿病心肌病的特征是左心室肥厚、心肌重塑和舒張/收縮功能障礙，以及不成比例地增加的左心室質量和心肌纖維化，最終發展為心力衰竭[6]。在心力衰竭的動物模型中，大蒜素可改善心功能不全和結構異常。本研究結果顯示，與對照組比較，大蒜素各劑量組EA，LVEF，FS降低；與模型組比較，大蒜素各劑量組EA，LVEF，FS升高，且隨著給藥劑量的增加而逐漸升高，量效關系明顯。表明大蒜素改善了心臟舒張和收縮功能，結合病理學結果，提示大蒜素減輕了糖尿病大鼠心臟的心室肥大和纖維化。

目前認為，TLR可能在識別免疫系統內源性或外源性抗原及炎性反應信號轉導的啟動中起重要作用[7]。TLR4可能在炎性細胞因子的合成和釋放中起重要作用，糖尿病心肌病是一種非特異性免疫應激反應，而TLR4基因的上調可能與糖尿病心肌病的發生和發展有關[8-9]。TLR4在先天免疫反應中起重要作用，既是細胞表面的免疫識別受體，又是跨膜信號轉導分子[10]。當TLR4被 PAMP或 DAMP激活時，可激活 MyD88和TRIF依賴性途徑，激活細胞內信號分子，如IL-1受體相關激酶（IRAKs）、腫瘤壞死因子受體相關因子（TRAFs）和 TAK1。因此，最終形成激活 NF-κB的主要和次要信號波，NF-κB誘導炎性細胞因子的轉錄和翻譯，并導致炎性介質的大量釋放。本研究結果顯示，NF-κB信號通路的激活被證明是大鼠糖尿病心肌病發病的核心。通過損傷誘導的氧化應激，細菌內毒素和細胞因子、NF-κB可被激活[11]。急性炎癥中，NF-κB可調節多種炎性基因啟動子，其產物如TNF-α，IL-1β和IL-6對炎癥過程至關重要。NF-κB活化增強轉錄炎性細胞因子和已知的細胞因子，反過來又激活NF-κB[12-14]。本研究結果顯示，大蒜素能抑制TLR4，NF-κB mRNA及蛋白的表達，抑制炎性因子IL-2，IL-6，TNF-α的表達，且量效關系明顯。

綜上所述，大蒜素改善糖尿病心肌病大鼠心臟舒張和收縮功能，減輕心室肥大和纖維化程度，其機制可能與大蒜素能抑制炎癥信號通路TLR4及INF-κB mRNA、蛋白表達水平，進而抑制炎性因子IL-2，IL-6，TNF-α的表達有關。