固本安神膠囊質(zhì)量標準研究*

張玉昆，馮月男，孫思邈，牛雯穎

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

固本安神膠囊是由葛根、黃芩、五味子、生地、淫羊藿、巴戟天等12味中藥組方，是應(yīng)用多年的臨床經(jīng)驗方劑，治療陰陽兩虛型更年期綜合征效果顯著。西醫(yī)治療更年期多以補充激素水平為手段，但不良反應(yīng)較多[1]。中藥復(fù)方的多藥效成分對應(yīng)疾病多靶點的治療較西藥單一靶點治療更年期不同癥狀更加具有適應(yīng)性[2-3]。課題組前期研究已確立了固本安神膠囊的制備工藝[4-5]，本研究中旨在建立其質(zhì)量標準?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DT201型電子天平（千分之一，意歐儀器儀表有限公司）；電子分析天平（十萬分之一，梅特勤-托利多上海公司）；ZF-7型紫外線分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；UV-1601PC型紫外可見分光光度儀（日本島津公司）；MP5200H型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；硅膠G薄層板（自制）；玻璃點樣毛細管。

1.2 試藥

葛根對照藥材（批號為201407-121551），葛根素對照品（批號為201318-110752），黃芩對照藥材（批號為 201407-120955），黃芩苷（批號為 201402-112002），五味子對照藥材（批號為 201410-120922），五味子醇甲（批號為201411-110857），均購自中國食品藥品檢定研究院；固本安神膠囊（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院自制，批號為 201801-201806）；乙酸乙酯、丁酮、三氯甲烷、氨水、甲醇、石油醚（60～90℃）、甲酸、正丁醇、甲酸乙酯，均為分析純，均購自天津科密歐公司。

2 方法與結(jié)果[6-10]

2.1 薄層色譜鑒別

葛根：取精細研磨的本品4 g，置25 mL Erlenmeyer燒瓶中，加10 mL乙酸乙酯，超聲處理21 min，濾過后，將濾液蒸發(fā)至干，加入1 mL甲醇以溶解殘渣，即得供試品溶液。以原方等比按配方工藝制成不含葛根的樣品，同法制備陰性對照品溶液。取對照藥材葛根0.8 g，置25 mL Erlenmeyer燒瓶中，按供試品溶液制備方法制備成對照藥材溶液。取葛根素對照品適量，用甲醇溶解成為1∶1的溶液，即得對照品溶液。分別精密吸取上述供試品溶液與陰性對照品溶液各2 μL、對照藥材溶液與對照品溶液各0.5 μL，在同一硅膠G板底部一條直線上間隔點板后，放入以氯仿-甲醇-水（14∶5∶0.5，V∶V∶V）為展開劑的展開缸中，展開，取出，陰干，將G板置紫外光燈下，于365nm波長下檢視。結(jié)果見圖1 A。

五味子：取精細研磨的本品4 g，置25 mL Erlenmeyer燒瓶中，加15 mL氯仿，超聲處理25 min，濾過，將濾液蒸發(fā)至干，加入1 mL氯仿溶解殘渣，即得供試品溶液。取對照藥材五味子0.9 g，置25 mL Erlenmeyer燒瓶中，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取對照品五味子醇甲，用甲醇溶解成1∶1的溶液，即得對照品溶液。以原方等比按配方工藝制成不含五味子的樣品，按供試品溶液制備方法制備不含五味子的陰性對照品溶液。分別精密吸取上述供試品溶液與陰性對照品溶液各5 μL、對照藥材溶液與對照品溶液各2 μL，在同一硅膠G板底部一條直線上間隔點板后，放入石油醚（30～60℃）-C3H6O2-HCOOH（15∶5∶1，V∶V∶V）的上層溶液作為展開劑的展開缸中，取出陰干，將硅膠G板置紫外光燈下，于254 nm波長處檢視。結(jié)果見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

黃芩：取精細研磨的本品3 g，精密稱定，置25 mL Erlenmeyer燒瓶中，加25 mL甲醇，超聲處理45 min，濾過，將濾液蒸發(fā)至干，加入1 mL氯仿以溶解殘渣，即得供試品溶液。以原方等比按配方工藝制成不含黃芩的樣品，同法制備不含黃芩的陰性對照品溶液。取對照藥材黃芩0.9 g，置25 mL Erlenmeyer燒瓶中，依法制備對照藥材溶液。取對照品黃芩苷，用甲醇溶解為1∶1溶液，即得對照品溶液。分別精密吸取上述4種溶液各3 μL，在同一硅膠G板底部一條直線上，間隔點板后，放入以乙酸乙酯-丁酮 -甲酸 -水（10∶7∶1∶1，V∶V∶V∶V）為展開體系的展開缸中，展開，取出陰干，采用2%酸性三氯化鐵乙醇溶液顯色。結(jié)果見圖1 C。

2.2 葛根素含量測定[11-13]

2.2.1 最佳吸收波長確定

取葛根素對照品溶液適量，置紫外分光光度計中，于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，最大吸收均出現(xiàn)在250 nm波長附近，詳見圖2。參考2015年版《中國藥典（一部）》及相關(guān)文獻中葛根素含量檢測方法，最終確定檢測波長為250 nm。

圖2 葛根素紫外吸收光譜圖

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取0.002 g對照品葛根素，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，作為對照品貯備溶液。取5 mL，置25 mL容量瓶中定容，即得。

供試品溶液：取樣品（批號為201801）內(nèi)容物0.5 g，精密稱定，加入20 mL乙醇，于超聲水浴中超聲15 min，放冷后濾過；藥渣中加入20 mL乙醇再次超聲15 min，放冷，濾過；收集藥渣，加入20 mL乙醇，超聲15 min，放冷，濾過；取3次提取液加入乙醇定容至25 mL容量瓶。吸取 5 mL，裝入聚酰胺柱（80-100，3 g，內(nèi)徑 0.8～1.0 mm）上，用50 mL水洗脫，棄去水液，再以30 mL濃度為70%甲醇進行洗脫，將收集的洗脫液置蒸發(fā)皿中，蒸干，以70%甲醇溶解殘渣定容至25 mL。精密量取2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加水5 mL，加濃度為5%的NaNO21 mL，混勻，并靜置6 min后，再加入濃度為10%的 1 mL Al（NO3）3，混勻，再次靜置 6 min 后，加入 10 mL NaOH試液，混勻，用水定容，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗：以原方等比按配方工藝制成不含葛根的樣品，精密稱取0.5 g，依法制成不含葛根的樣品溶液，作為陰性樣品溶液。采用紫外分光光度法進行掃描。結(jié)果顯示，在250 nm波長下，陰性樣品溶液吸光度較小，說明本方法不干擾葛根素成分的測定。

標準曲線制備：精密量取葛根素對照品溶液0.5，1，2，3，4，6，8 mL，定容至 25 mL，依法于 250 nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標（Y）、葛根素質(zhì)量濃度為橫坐標（X，g/L）進行線性回歸，得回歸方程Y=67.858X+0.106 1，r=0.999 2（n=8）。結(jié)果表明，葛根素質(zhì)量濃度在0.003 2～0.011 2 g/L范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取0.002 g葛根素對照品，精密稱定，依法制備對照品溶液，精密吸取4 mL對照品溶液定容至25 mL，在250 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算質(zhì)量濃度。結(jié)果平均質(zhì)量濃度為0.006 5 g/L，RSD為2.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：分別取6批樣品，每份0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，采用紫外分光光度法進行測定。結(jié)果葛根素平均含量為220.42 μg，RSD為2.54%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為201801）適量，依法制備供試品溶液，吸取適量，在0～12 h內(nèi)每小時檢測 1次。結(jié)果葛根素平均含量為 220.65 μg，RSD為1.29%（n=13），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。樣品從提取至測定一般在2 h內(nèi)即可全部完成，故所建立的檢測方法可行。

加樣回收試驗：取樣6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入220.5 μg/mL葛根素對照品溶液1 mL，依法制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.2.4 含量測定

取6批樣品0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，采用紫外分光光度法測定含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品中葛根素含量測定結(jié)果（n=6）

3 討論

薄層色譜法廣泛用于中藥、中成藥中標志性物質(zhì)的檢測，方法簡單，準確度高。本研究中薄層展開劑比例多以《中國藥典》要求為準，可重復(fù)性相對較高。葛根為處方中君藥，主要活性成分為葛根素，故選擇葛根素作為含量檢測指標。葛根素屬異黃酮類，是以苯色酮環(huán)為基礎(chǔ)的一種酚類化合物，因此選用聚酰胺柱通過形成氫鍵的強弱進行分離純化葛根素，發(fā)現(xiàn)聚酰胺柱參數(shù)為80-100，3 g，內(nèi)徑 0.8～1.0 mm 時，可達到理想效果。紫外分光光度法靈敏度度相對較高，精密度試驗、重復(fù)性試驗及加樣回收試驗的RSD均小于3%，認為該方法簡單可行。本研究前期進行了葛根單味藥中葛根素的含量測定，不同產(chǎn)地的葛根素含量在3.0%～4.5%之間，差異較大，建議生產(chǎn)中購買品相上等的藥材，嚴格控制投料藥材的質(zhì)量。