刺梨葉質量標準研究*

王媛媛 ，雷 艷 ，馬 雪 ，劉春花 ，黃 勇 ，王愛民 ，李勇軍 △

（1.貴州科頓制藥有限責任公司，貴州 貴陽 550002； 2.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004）

刺梨葉又稱繅絲花葉，為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt.及單瓣繅絲花Rosa roxburghiiTratt.f.normalis Rehd.et Wils.的干燥葉，收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》（以下簡稱《標準》）[1]，其味甘、酸澀，歸脾、腎、胃經，用于治療積食飽脹、疥痛金瘡，是小兒消食開胃顆粒的主要藥材[2-4]，主要分布于貴州，四川、陜西、甘肅等地亦產[5]。目前，關于刺梨的研究報道較多[6-11]，但刺梨葉的研究報道較少，且主要集中于化學成分分離和藥理活性研究[12-13]，對刺梨葉的質量標準研究尚未見報道，《標準》中也僅見性狀描述、簡單顯色反應及薄層色譜鑒別試驗。本研究中參考文獻[14-15]，重新建立了刺梨葉薄層色譜鑒別方法，并對相關項目進行檢查，采用高效液相色譜（HPLC）法測定了刺梨葉中水解沒食子酸含量，可有效控制刺梨葉藥材的質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Camag Reprostar 3型薄層數碼成像系統（瑞士卡瑪公司）；EL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；CQ-250A-ST型超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）；WP-UP-Ⅱ-20型超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）；UltiMate 3000型高效液相色譜儀（包括系統控制器、輸液泵、脫氣組件、低壓梯度組件、自動進樣器、柱溫箱、溫控樣品室、ΜV-VIS檢測器及Chromeleon色譜數據工作站）；Allegra64R型臺式冷凍離心機（美國貝克曼公司）。

1.2 試藥

刺梨葉對照藥材（批號為121355-200401）、沒食子酸對照品（批號為110831-200302）均購于中國食品藥品檢定研究院；薄層色譜硅膠板G（青島海洋化工有限公司）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；刺梨葉藥材共7批，樣品為貴州不同地區采收的4批藥材和收購的3批藥材樣品，由貴陽中醫學院藥學院生藥實驗室孫慶文教授鑒定為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt.的干燥葉，具體采收地見表1。

表1 刺梨葉藥材信息

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

取樣品粉末0.2g，加無水乙醇15mL，超聲處理10min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使其溶解，作為供試品溶液。另取刺梨葉對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各3 μL，分別點于同一硅膠 G板上，以石油醚-丙酮（3∶1，V∶V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，詳見圖1。

圖1 薄層色譜圖

2.2 相關項目檢查

照2015年版《中國藥典（四部）》通則0832第二法中水分測定法、通則2302中總灰分測定法、通則 2201中的醇溶性浸出物測定法項下熱浸法測定7批刺梨葉藥材的水分、總灰分及浸出物，結果見表2。暫定本品水分不超過12.0%，總灰分不超過9.0%，乙醇浸出物不少于15.0%。

表2 刺梨葉水分、總灰分及浸出物測定結果（%，n=7）

2.3 沒食子酸含量測定

2.3.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Venusil XBP C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.5%醋酸溶液（3 ∶97，V∶V）；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，樣品中其他成分與沒食子酸分離度良好，色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.3.2 溶液制備

取刺梨葉藥材粉末（過3號篩）約0.25 g，精密稱定，精密加入10%鹽酸25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用10%鹽酸補足減失的質量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 mL，以水稀釋至25 mL，離心，去上清液，即得供試品溶液。取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加30%甲醇溶解，制成每1 mL含沒食子酸0.526 mg的溶液，搖勻，即得對照品貯備液，精密量取適量，配制成質量濃度為52.60 μg/mL的對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密量取對照品貯備液適量，置10 mL容量瓶中，用30%甲醇定容，配制成質量濃度分別為 5.26，26.30，52.60，78.90，99.40 μg/mL 的系列對照品溶液，依法進樣，測定峰面積，以對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.481 1X-0.206 4，r=0.999 9（n=5）。結果表明，沒食子酸質量濃度在5.26～99.40μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

中間精密度試驗：以不同的試驗人，在不同時間分別取同一批藥材（批號為20160824）粉末各0.25 g，精密稱定，制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積。結果的RSD為0.66%（n=6），表明中間精密度良好。

重復性試驗：分別取同一批刺梨葉藥材（批號為20160824）粉末 0.125，0.25，0.50 g各 3 份，精密稱定，制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積。結果的RSD為1.21%（n=9），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液10 μL，按擬訂色譜條件分別于 0，1，2，4，8，24 h 時進樣測定峰面積。結果的RSD為1.33%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：分別取已知含量的6份同一批樣品（批號為20160824）粉末各0.25 g，精密加入沒食子酸對照品，分別進樣測定，計算回收率。結果見表3。

表3 沒食子酸加樣回收試驗結果（n=6）

2.3.4 樣品含量測定

精密稱取7批刺梨葉藥材（批號分別為20170901，20170806，20161011，20160825，20160824，20160817，20160816）適量，按擬訂方法制備供試品溶液，依法測定沒食子酸含量。結果7批樣品中沒食子酸的含量分別為0.85% ，1.26% ，0.97% ，0.91% ，1.53% ，1.04% ，0.86%，平均含量為1.06%。暫定刺梨葉藥材沒食子酸含量不得少于0.80%。

3 討論

分別考察了以氯仿-甲醇-甲酸（7∶1∶0.1，V∶V）、氯仿 -乙酸乙酯（50∶1，V∶V）和石油醚 -丙酮（3∶1，V∶V）為展開劑，5%磷鉬酸乙醇溶液顯色，于105℃加熱至斑點顯色清晰，試驗結果表明，以石油醚-丙酮（3∶1，V∶V）為展開劑的分離度良好，Rf值適中，顯色清晰，故選擇石油醚 -丙酮（3∶1，V∶V）為展開劑。

分別以8%鹽酸、10%鹽酸、12%鹽酸為提取溶劑進行考察，分別加熱回流提取1.0 h，結果表明，10%鹽酸對沒食子酸提取率最高，故選擇10%鹽酸作為提取溶劑。以10%鹽酸作為提取溶劑，分別加熱回流提取0.5，1.0，2.0 h，結果提取時間為1.0 h時沒食子酸已提取完全，當提取時間繼續增加時，提取率不再增加，因此確定提取時間為1.0 h。

分別考察了不同色譜柱，ODS-3柱（250mm×4.6mm，5 μm），Venusil XBP C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；不同流速，如0.90 mL/min，1.0 mL/min，1.1 mL/min；不同柱溫，如22，25，28℃。結果顯示，在上述條件下，供試品溶液中，在與對照品溶液相同時間的出峰一致，綜合考慮分離度、理論板數及出峰時間等因素的影響，發現以甲醇-0.5%醋酸溶液（3∶97，V∶V）為流動相，柱溫為 25℃時，沒食子酸與其他組分的分離度良好。另外，在測定沒食子酸的紫外吸收光譜圖時發現，在270 nm波長處有最大吸收，故以此為檢測波長。