人角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染的差異表達基因

鄧威威 梁盼盼 蘇真 龔子鑒 陳劍

【摘要】目的 篩選角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染的差異表達基因與關鍵基因。方法 構建紅色毛癬菌感染人工表皮模型與陰性對照組一起進行RNA-seq測序分析。結果 在紅色毛癬菌孢子感染人工表皮后共篩選出了1 564個差異表達基因，包括1 102個上調基因與462個下調基因。這些差異基因的Go分析結果主要富集于生物學調控、膜及膜組分和催化功能。通過kegg通路分析，差異表達基因主要富集于與結直腸癌、賴氨酸降解和肌醇磷酸代謝相關通路。另外，蛋白互作分析發現PHLPP2和TOP2B這2個基因節點的度最高，可能在人角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染中具有重要的作用。結論 篩選出了1 564個角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染的差異表達基因，這些基因可能在人角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染中具有重要作用。

【關鍵詞】人工表皮;紅色毛癬菌;核糖核酸-seq

【Abstract】Objective To screen the differentially-expressed and key genes in the keratinocytes in response to Trichophyton rubrum infection.? Methods The artificial epidermis model infected by Trichophyton rubrum was established. RNA-seq was performed in the reconstructed human epidermis and negative controls.? Results A total of 1 564 differentially-expressed genes were identified， including 1 102 up-regulated genes and 462 down-regulated genes after the artifical epidermis was infected by Trichophyton rubrum. The gene ontology （GO） analysis indicated that the majority of the target genes were related to biological regulation， membrane， membrane component and catalytic function. Kegg pathway analysis revealed that most target genes were distributed in the colorectal cancer， lysine degradation and inositol phosphate metabolism signaling pathways. In addition， protein-protein interaction networks demonstrated that PHLPP2 and TOP2B had the highest degree of connected node， which might play a critical role in keratinocytes challenged with Trichophyton rubrum.? Conclusions A total of 1 564 differentially-expressed genes are screened in the keratinocytes in response to Trichophyton rubrum infection， which probably play a pivotal role in keratinocytes against Trichophyton rubrum infection.

【Key words】Reconstructed human epidermis;Trichophyton rubrum;RNA-seq

皮膚癬菌感染導致的淺部真菌病是人類最常見的疾病之一，發病率非常高，累及約20% ～ 25%的世界人口[1-3]。不僅嚴重地影響了患者的身心健康而且導致了巨額的醫療支出[4-6]。其中紅色毛癬菌是最主要的致病菌[7-8]。其感染多呈慢性且極易復發。如何徹底清除紅色毛癬菌，避免復發一直是治療上的一個難題。由于紅色毛癬菌感染主要局限于表皮角質層，角質形成細胞對紅色毛癬菌的識別是激發皮膚炎癥和免疫反應的關鍵，在機體徹底清除紅色毛癬菌的過程中發揮重要作用。本研究構建了新型的紅色毛癬菌感染人工表皮模型。并以此模型開展人角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染的差異表達基因的研究。

材料與方法

一、人工表皮

人工表皮EpkSkin購自上海斯安諾生物科技有限公司。將人工表皮模型從營養瓊脂轉移到加有2 ml維持培養基的12孔板里，放入37℃， 5.0% CO2的培養箱里培養過夜，第2日更換培養基用于后續實驗。

二、紅色毛癬菌的標準株T1a

紅色毛癬菌的標準株T1a，由中國醫學微生物菌種保藏管理中心（CMCC，China Medical Culture Collection，中國醫學科學院南京皮膚病研究所）贈予。經過形態學鑒定、內轉錄間隔區測序和核糖體RNA大亞基D1-D2區序列分析鑒定為紅色毛癬菌。

三、主要試劑與儀器

維持培養基購自上海斯安諾生物科技有限公司，馬鈴薯瓊脂糖培養基購于英國Oxoid，氯化鈉購自天津市大茂化學試劑場，Whatman 濾紙購自英國Whatman。生物安全柜購自江蘇蘇凈集團有限公司，CO2培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific，超速離心機購自美國貝克曼庫爾特。

四、方 法

1.感染模型構建

感染模型的構建參考既往研究成果[9]。紅色毛癬菌T1a接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，27℃培養14 d，連續活化2次以上，每管加入3 ～ 4 ml的0.85%無菌生理鹽水，用接種環輕輕刮取菌落表面，收集孢子和菌絲的混合懸液。用11 μm孔徑的無菌Whatman濾紙過濾得到孢子懸液。用0.85%無菌生理鹽水清洗2次，4 000 rpm，離心10 min，棄去上清液，加適量0.85%無菌生理鹽水重懸沉淀的孢子。用細胞計數板進行孢子計數，制成終濃度分別為8×104 cfu/ml的孢子懸液備用。在人工表皮的中央垂直加入5 μl混勻的孢子懸液（400個孢子）構建感染模型，加等量的無菌生理鹽水作陰性對照。37℃，5% CO2培養，每2 d更換維持培養基。

2.人工表皮角質形成細胞轉錄組測序

RNA提取：感染后96 h，分離人工表皮，采用Trizol法提取總RNA，隨后使用Illumina HiSeq平臺進行RNA-seq測序。本研究中采用RPKM（Reads Per Kilobase Millon mapped reads）來表示基因表達量水平，我們采用|log2 fold change|≥1并且q≤0.05作為篩選差異表達基因的標準。

五、統計學處理

利用The Go 數據庫進行Go分析，通過Kegg數據庫進行kegg分析，通過String數據庫進行蛋白互作（ppi）分析[10-13]。

結果

一、紅色毛癬菌感染后人工表皮角質形成細胞基因表達的變化

在人工表皮受到紅色毛癬菌感染后，我們將人工表皮進行RNA-seq分析，RNA-seq結果的熱圖。我們共篩選出了1 564個差異表達基因，包括1 102個上調基因與462個下調基因。在這些差異表達基因中我們發現了2個具有抗真菌感染作用的基因即Septin-7（上調了2.6倍）和Annexin-A1（上調了2.4倍）。

二、紅色毛癬菌感染后人工表皮角質形成細胞差異表達基因的Go分析

為了了解差異表達基因的功能，我們將差異表達基因進行了Go功能分析，結果具有統計學意義（P < 0.05）。Go分析結果主要富集于可能與應對紅色毛癬菌感染相關的生物學調控、膜及膜組分和催化功能。

三、紅色毛癬菌感染后人工表皮角質形成細胞差異表達基因的kegg分析

為了了解差異表達基因所參與的信號通路，我們將差異表達基因進行了kegg分析，結果具有統計學意義（P < 0.05）。

四、紅色毛癬菌感染后人工表皮角質形成細胞差異表達基因的ppi分析

為了篩選人工表皮角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染的關鍵基因，我們將差異表達基因進行ppi分析。PHLPP2和TOP2B這2個基因具有最高度值，可能是角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染的關鍵基因。

討論

以往主要是通過大鼠、豚鼠等動物感染模型以及角質形成細胞和皮膚癬菌的共培養模型進行皮膚癬菌病發病機制研究[16-18]。但是對于紅色毛癬菌研究以上2種模型都有一定的局限性。首先，紅色毛癬菌是典型的親人性皮膚癬菌，自然條件下極少感染小鼠等實驗動物，人類和動物對紅色毛癬菌不同的免疫應答被認為是導致紅色毛癬菌感染種屬差異的重要原因。因此動物感染模型不是研究紅色毛癬菌感染免疫機制的最佳選擇。其次，普通的共培養模型中紅色毛癬菌直接浸泡生長于培養基中和感染人體時主要在角質層中生長不同，因此通過上述模型得出的結論仍有一定的偏差。因此我們采用由人角質形成細胞三維培養形成的人工表皮，感染紅色毛癬菌來構建感染模型。此模型中，紅色毛癬菌在角質層中侵襲生長，而表皮中的角質形成細胞維持大致正常的形態和結構，完全符合紅色毛癬菌感染的病理表現并且很好地克服了由物種差異導致的研究偏差[9]。

近年來，除本課題組外，還有數個研究通過構建皮膚癬菌感染人工表皮的模型，來開展皮膚癬菌病發病機制的研究。這些研究接種的菌量明顯高于我們的研究，模型中大量的菌絲直接侵襲表皮全層，破壞了角質形成細胞結構和形態，這和真實的臨床紅色毛癬菌感染情況不符，因此我們認為由此類模型得出的研究結果可能有一定的偏差。因為角質形成細胞在受到破壞的情況下，其損傷識別受體可以識別損傷相關分子模式，進而激發一系列繼發于角質形成細胞損傷導致的信號通路激活、炎癥因子分泌。干擾角質形成細胞針對紅色毛癬菌感染原發免疫相關機制的研究。

我們共篩選出了1 564個差異表達基因，包括1 102個上調基因與462個下調基因。在這些差異表達基因中上調基因占大多數，而下調基因只占少部分，這反映人工表皮角質形成細胞可能上調某些基因來應對紅色毛癬菌的感染。有研究表明Septin-7可以在內皮細胞中形成內吞白假絲酵母菌的復合物[14]。Annexin-A1表達于口腔上皮細胞，在正常條件下具有抗白假絲酵母菌感染功能[15]。在這些差異表達基因中我們發現了2個具有抗真菌感染作用的基因Septin-7和Annexin-A1，Septin-7上調了2.6倍，Annexin-A1上調了2.4倍，說明它們可能在應對紅色毛癬菌感染中具有重要的作用。

我們通過感染模型的構建以及RNA-seq分析，得到了人角質形成細胞在應對紅色毛癬菌感染的差異表達基因數據，再通過Go、kegg以及ppi分析了解這些差異表達基因的功能。差異表達基因主要富集于賴氨酸降解、磷酸肌醇代謝以及大腸腫瘤相關通路。目前還沒有研究表明這些通路與抗真菌感染直接相關。值得注意的是，富集的通路中并沒有免疫通路，這可能說明了人角質形成細胞識別紅色毛癬菌產生免疫應答的能力不足，符合臨床上紅色毛癬菌感染炎癥輕微的特性。

值得注意的是，ppi分析中2個度值最高的基因PHLPP2和TOP2B可能在角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染中扮演著重要的作用。據報道，抑制PHLPP2的表達會導致c-JUN的激活，并最終提升TNF-α的表達水平[19]。

綜上所述，深入研究人角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染的基因表達差異，對于探究皮膚癬菌發病機制以及開發更有效的皮膚癬菌病防治藥物和方法都顯得尤為重要。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2018-12-08）

（本文編輯：楊江瑜）