珠江源頭入侵種波氏吻蝦虎的遺傳多樣性分析

顏岳輝，丁雪梅，李強，李旭，唐利洲*

(1. 西南林業大學，昆明650224； 2. 曲靖師范學院，云南高原生物資源保護與利用研究中心，云南曲靖655011)

波氏吻蝦虎Rhinogobiuscliffordpopei隸屬于鱸形目Perciformes蝦虎魚科Gobiidae蝦虎魚亞科Gobiinae吻蝦虎魚屬Rhinogobius(Nichols，1925)，是一類小型淡水性底棲魚類，模式標本發現于長江水系的洞庭湖(Nichols，1925)，隨后入侵珠江及云南的高原湖泊(伍漢霖，鐘俊生，2008；陳小勇，2013)。該物種屬中國特有種，目前廣泛分布于長江、黃河、珠江、遼河、錢塘江等水系的支流、湖泊和水庫生境中，具有較高的經濟價值(伍漢霖，鐘俊生，2008；李帆，2011)。有關該物種形態特征、行為習性、食性、繁殖、營養生態位、生境選擇與分化、生長和種群動態等特征已有記述(倪勇，伍漢霖，2006；伍漢霖，鐘俊生，2008；王華，郭延蜀，2009；李帆，2011；Guoetal.，2012，2013，2014，2016，2017)。波氏吻蝦虎線粒體基因組測定和系統發育關系的分析表明，其線粒體基因組全長16 511 bp，包括13個蛋白質編碼基因，22個tRNA基因，2個rRNA基因和1個控制區，構建的系統發育樹顯示，波氏吻蝦虎形成了一個單系群，再次驗證其獨立種的分類地位(Zhongetal.，2018)。除此之外，有關波氏吻蝦虎群體遺傳學和種群生態學方面的研究工作則未見報道，尤其是涉及該物種在入侵地的遺傳多樣性水平和遺傳變異的研究較為缺乏。因此，從群體遺傳學角度探討波氏吻蝦虎在珠江源頭水體的群體遺傳多樣性和遺傳分化程度，揭示其遺傳多樣性形成過程與影響成因，可以為控制該入侵種的擴散分布和生態危害提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 采樣

珠江由西江、北江、東江和珠江三角洲等組成，西江是珠江的干流，發源于云南省曲靖市沾益區境內的馬雄山，南盤江是西江的第一段河流。96份波氏吻蝦虎樣本采自南盤江上游的云南省曲靖市的沾益區白浪水庫(BL)、經濟開發區面店水庫(MD)、麒麟區瀟湘(XX)、沿江(YJ)、三寶(SB)、獨木(DM)、太陽島(TYD)和漲水坡水庫(ZSP)及陸良縣響水壩(XSB) 9個自然水庫(表1，圖1)。樣本用95%乙醇固定，4 ℃保存。

1.2 基因組總DNA提取、PCR擴增與測序

采用北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供的基因組DNA提取試劑盒抽提總DNA，提取方法參考試劑盒的方案。以GenBank數據庫已有波氏吻蝦虎線粒體細胞色素b(cytb)基因全序列(登錄號：KX898434)為參考，由昆明碩擎生物科技有限公司設計PCR擴增引物，引物序列為F： 5’-AACCACT-ACCCCAGAACCA-3’和R：5’-CTTTTCGTCATATCCGGTGCCC-3’。反應體系為50 μL：1 μL DNA母液，2 μL上、下游引物，25 μL 2×Easy Taq PCR Supermix(TRANSGEN BIOTECH)，22 μL ddH2O。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃續延伸5 min，4 ℃保存。取1 μL擴增產物混合2 μL 6×Loading buffer凝膠加樣緩沖液，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察拍照。PCR擴增產物送昆明碩擎生物科技有限公司測序。

圖1 波氏吻蝦虎樣本采集點Fig. 1 Sampling sites of Rhinogobius cliffordpopei

種群代碼見表1

Population code see table 1

1.3 數據分析

運用Chromas 2.62(Kyte & Doolittle，1982)和Seqman(Allex，1999)進行同源排序，結合手動校對序列。運用DnaSP 5.10(Rozas & Rozas，1995)統計序列的多態性信息，分析種群的單倍型多樣性、核苷酸多樣性及標準差。運行MrModeltest 2.2(Darribaetal.，2012)檢驗核苷酸最適模型。以GenBank數據庫下載的吻蝦虎魚屬的子陵吻蝦虎R.giurinus(R.giurinus1：KF371534、R.giurinus2：KP892753、R.giurinus3：NC_022692)、褐吻蝦虎R.brunneus(R.brunneus1：NC_028435、R.brunneus2：KT601096、R.brunneus3：AB872439)、短吻紅斑吻蝦虎R.rubromaculatus(R.rubromaculatus1：AY137607、R.rubromaculatus2：AY137606、R.rubromaculatus3：AY137604)作為外群，利用MrBayes 3.2(Ronquist & Huelsenbeck，2003)構建波氏吻蝦虎單倍型間的貝葉斯樹，以HKY+G為最適模型，運算1 000萬代，每100代取樣一次，去掉burn-in運算開始25%的不可信區域，直到鏈收斂，即分裂頻率平均標準差小于0.01停止運算。運行MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)計算種群間和單倍型間遺傳距離，并運用最大似然法(maximum-likelihood method)構建系統進化樹。運行Network 5.0(Richardsetal.，1996)，利用中連法(median-joining method)構建波氏吻蝦虎群體單倍型間的網絡圖。其次，利用Arlequin 3.5(Excoffier & Lischer，2010)的分子變異分析(AMOVA)模塊(Excoffieretal.，1992)分析群體遺傳結構。

2 結果

2.1 遺傳多樣性與種群動態

波氏吻蝦虎cytb基因全序列長1 141 bp，包括1 072個保守位點，69個變異位點，其中單突變位點3個，簡約信息位點66個，無插入和缺失位點。96只個體檢測出cytb單倍型5個(Hap1～Hap5，登錄號：MK204741～MK204745)，單倍型間的遺傳距離為0.001～0.064，單倍型多樣性(Hd)為0.359±0.059，核苷酸多樣性(Nd)為0.021±0.010(表2)。9個地理種群的76只個體共享單倍型Hap1，種群DM和ZSP共享單倍型Hap2、Hap3，種群YJ獨有單倍型Hap4，種群ZSP獨有單倍型Hap5(表2)。所有地理種群中，除BL、XX、MD、SB、TYD和XSB僅有1個單倍型Hap1，未分析出多樣性信息外，種群DM的Hd(0.709±0.083)和Nd(0.023±0.012)最高，種群ZSP的分別為0.561±0.154和0.017±0.009，而種群YJ的均最低，分別為0.200±0.154和0.001±0.001(表2)。種群DM、ZSP及全部群體的中性檢驗顯示，其Tajima’sD和Fu’sFs檢驗均不顯著(P>0.05)，而種群YJ的Tajima’sD為顯著性負值(P<0.05)，說明波氏吻蝦虎的DM、ZSP種群及全部群體未檢測到種群擴張，而支持YJ種群經歷過近期種群擴張(表2)。

表2 珠江源頭波氏吻蝦虎種群遺傳多樣性與中性檢驗Table 2 Results of genetic diversity and neutrality test of Rhinogobius cliffordpopei at the source of the Pearl River

2.2 分子系統演化關系

分子系統發育關系的貝葉斯樹顯示，與外群子陵吻蝦虎、褐吻蝦虎和短吻紅斑吻蝦虎分開，波氏吻蝦虎的5個單倍型Hap1～Hap5以高自舉值構成了一個獨立的單系群，驗證其獨立種分類地位(圖2)。其次，波氏吻蝦虎群體分化為 2個系統分支，單倍型Hap2、Hap5構成的第一分支和單倍型Hap4、Hap1和Hap3構成的第二分支(圖2：左)。基于最大似然法構建的系統樹分析出與貝葉斯樹一致的拓撲結構。同時，單倍型間網絡圖同樣支持波氏吻蝦虎群體分化為2個系統分支(圖2：右)。

2.3 群體遺傳結構

波氏吻蝦虎群體遺傳結構AMOVA分析結果顯示(表3)，該物種整個群體種群間和種群內的遺傳變異占總遺傳變異組分的比率分別為62.99%和37.01%，固定指數FST為0.630(P<0.01)，即種群間的遺傳變異顯著高于種群內，說明波氏吻蝦虎群體具有顯著的遺傳分化格局。該物種全部群體的平均遺傳距離為0.014±0.002，種群DM與ZSP、YJ之間的遺傳距離分別為0.038±0.005、0.016±0.002，種群ZSP與YJ之間的遺傳距離為0.048±0.006，反映出地理種群間的遺傳差異程度較大。

3 討論

3.1 波氏吻蝦虎的種群遺傳多樣性

圖2 波氏吻蝦虎單倍型間的貝葉斯樹(左)和網絡圖(右)
Fig.2 The Bayesian inference tree (left) and network relationship (right) ofRhinogobiuscliffordpopeihaplotypes

左圖中分支以上的數字是貝葉斯樹的自舉值； 而最大似然樹自舉值顯示在分支的下面； 右圖中每個實心圓代表一種單倍型，實心圓大小與單倍型頻率呈正比，圓圈(mv)代表缺失單倍型，每條線條代表一步突變

In the left figure，the numbers above the branches are the bootstrap values of Bayesian inference tree； maximum-likelihood tree bootstrap values are shown under the branches； in the right figure，every solid cycle means a haplotype； the size of solid circles is proportional to haplotype frequency，the cycle (mv) represents missing haplotypes (not sampled or extinct)，every line represents one mutation step

表3 波氏吻蝦虎群體遺傳結構的分子變異分析Table 3 The analysis of molecular variance (AMOVA) of genetic structure of Rhinogobius cliffordpopei

通過與上述物種的比較，波氏吻蝦虎群體的遺傳多樣性表現為低單倍型多樣性與高核苷酸多樣性，可能是該物種入侵珠江源頭9個自然水庫種群所在區域，群體的有效種群較低，隨后經歷了地理隔離種群的再次分化和高度的遺傳瓶頸效應。據相關文獻的記述，波氏吻蝦虎成為珠江源頭云南地區的入侵種，可能主要是外省隨家魚苗帶入造成的(路瑞鎖，宋豫秦，2003；伍漢霖，鐘俊生，2008；陳小勇，2013)。家魚苗的多次放養可能成為波氏吻蝦虎入侵云南高原湖泊和水庫自然種群的途徑，可能因入侵地新環境的選擇壓力產生定居的瓶頸效應，而處于小種群狀態，而水庫大壩和水電站的修建導致了種群的再次隔離分化，從而出現了群體低單倍型多樣性與高核苷酸多樣性的特征。同時，9個自然水庫種群存在的遺傳多樣性差異表現為，種群DM、ZSP均為高遺傳多樣性水平，而種群YJ則為較低的遺傳多樣性，其他種群未分析出遺傳多樣性信息。上述種群所在的水庫均為飲用水或灌溉用水，筑以大壩進行保護，且均有多次家魚苗放養或增殖放流的歷史。因此，由于多次隨家魚苗引入，波氏吻蝦虎的不同來源基因型個體可能在種群DM、ZSP進行了匯合，很大程度上彌補了奠基者效應或瓶頸效應造成的遺傳多樣性下降，反而為種內雜交創造新的單倍型或基因型提供了機會，因此2個種群保持了種群穩定和較高的遺傳多樣性水平(施雯等，2010)。同時，可能受到了近期奠基者事件或瓶頸效應的影響，缺乏后續有效的人為引入或不同單倍型對不同生境具有的適應性差異，種群BL、XX、MD、SB、TYD、XSB僅保持了具有唯一單倍型個體構成的種群，均為一個共同祖先繁衍形成的子代個體，種群YJ則出現了種群擴張(Tajima’sD=-1.873，P=0.010)和新突變的積累而表現為低水平的遺傳多樣性，這些水庫種群很可能面臨近交衰退和種群滅絕的風險，其入侵能力將大大降低。

3.2 波氏吻蝦虎群體的遺傳結構

淡水魚類的生活環境因受到河流河段的限制，較容易出現地理隔離影響下的種群分化格局(鄭新，2016)。構建的系統發育樹和網絡圖表明，波氏吻蝦虎種群存在一定的分化結構，5個單倍型分化為2支，單倍型Hap2、Hap5形成的第一分支(種群DM的3只個體和種群ZSP的10只個體構成)，以及單倍型Hap1、Hap3、Hap4形成的第二分支(種群BL、XX、MD、YJ、SB、TYD、XSB和種群DM的8只個體、種群ZSP的2只個體構成)。AMOVA結果證實，波氏吻蝦虎種群間的遺傳變異率顯著高于種群內，且具有較高的遺傳分化系數。波氏吻蝦虎在珠江源頭的自然水庫群體呈現出顯著的遺傳分化結構，亦有其他入侵種在入侵地表現出相似的遺傳結構(劉紅艷等，2016；秦凱波等，2017)。主要原因在于波氏吻蝦虎各種群所在的自然水庫生境，均建設有蓄容作用的大壩，可能提供了入侵種群相對封閉的水域條件，阻斷了種群間的遷移擴散路徑，種群間基因流受限，繼而產生了種群間的生境隔離與遺傳分化。

外來物種的適應性進化成為其入侵過程中的重要應對對策，而其遺傳多樣性被一致認為是影響外來物種適應和進化潛力的關鍵因素，成為影響入侵成功與否的重要因素之一(施雯等，2010)。本研究中，波氏吻蝦虎群體具有較高的遺傳多樣性水平與顯著的遺傳結構，其豐富的核苷酸多樣性來源于多次人為無意識引入而產生了種內雜交，以及水利大壩修建導致了隔離種群的遺傳分化，可能成為該物種成功入侵珠江源頭地區的重要原因。自20世紀60年代江南四大家魚引入云南高原地區，無意識地將波氏吻蝦虎帶入了高原湖泊與水庫自然生境(路瑞鎖，宋豫秦，2003)。入侵種群定居過程中可能經歷了奠基者事件和遺傳瓶頸效應的嚴重影響，部分種群出現遺傳多樣性的降低，然而在各水庫、湖泊自然種群的人為交叉放養家魚苗的活動，可能將單一祖先起源的相同單倍型個體和不同來源的單倍型個體進行了擴散。因而，波氏吻蝦虎在不同的水庫自然種群呈現出遺傳差異特征，具有共同起源但適應能力較強的單倍型個體入侵了所有的自然生境，有些不同來源的單倍型個體對于生境具有適應性差異，加上某些種群(如種群DM和ZSP)因人為多次引入了不同來源的單倍型而發生了匯合。故而，部分種群共享且擁有唯一單倍型或低的遺傳多樣性，少數種群具有較高的遺傳多樣性水平和種群穩定性，后者可能成為人為多次引種的匯合地，也可能成為波氏吻蝦虎在珠江源頭入侵的擴散起源地(施雯等，2010；劉紅艷等，2016)。珠江上游地區存在因大量水利大壩建設形成的破碎化生境(陳艷等，2017；陳鋒等，2018)，外來物種入侵加重了生態危害。為有效保護珠江土著魚類物種多樣性與水生生物多樣性，本研究建議，應該嚴格加強波氏吻蝦虎在珠江上游地區的入侵管控，采取有效措施減少因人為放養家魚苗和增殖放流帶來的無意識擴散，尤其要重視針對波氏吻蝦虎遺傳多樣性較高種群的監測和入侵防治，加強該物種入侵生態學的系統研究工作，并充分考慮在水利大壩旁設置土著魚類的洄游通道。

致謝：本研究受云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態適應性進化重點實驗室、云南省高校云南特境內生菌資源的開發與利用科技創新團隊的資助，在此一并予以感謝!