黑瑪麗精子包特性及pH和溫度對其精子活力的影響

李紀同，楊磊，王晶，王冰，楊威利，李瑞靜，張永忠*

(1. 鄭州大學附屬兒童醫院腎臟風濕科，鄭州450018； 2. 河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室，鄭州450018；3. 聊城大學生命科學學院，山東聊城252059)

黑瑪麗Poecilialatipinna隸屬于鳉形目Cyprinodontiformes花鳉科Poeciliidae花鳉屬Poecilia，為卵胎生熱帶魚類，又名黑摩利，全身漆黑如墨，體型較小。因繁殖周期短、成本低，可作為水族館及家庭飼養的觀賞動物，具有較高的經濟價值。但產量低，長期供不應求。因此，研究黑瑪麗精子的生物學特性及外界環境因素對其精子運動的影響，可為其人工授精、提高規?；B殖產量提供理論依據。

目前，有關環境中pH、溫度、離子成分、滲透壓等因素對魚類精子運動活力的研究，在卵生魚類中已有較多報道，但在卵胎生魚類中較少。研究者以劍尾魚Xiphophorushelleri(Huangetal.，2004；Dongetal.，2006)和孔雀魚Poeciliareticulata(Tanaka & Oka，2005；郭明申等，2006)為實驗材料對其精子的生物學特性進行了初步研究，但尚未有關于黑瑪麗精子包特性，以及環境條件對其精子運動活力影響的研究報道。黑瑪麗為卵胎生，體內受精，雌魚受精后40～70 d就可繁殖，每次可產20～60條仔魚甚至更多，仔魚出生后生長5～6個月就能進行繁殖。黑瑪麗具有精子包結構，精子包在交尾時隨精液被輸送到雌魚體內，在特定條件下精子包破裂，釋放出游離的精子，精子的激活和運動規律等特性與卵生魚類顯著不同。因此，本文就黑瑪麗精子包特性以及pH和溫度對其精子運動活力的影響進行了初步研究，旨在為黑瑪麗等卵胎生魚類的人工授精，以及生殖生物學特性等研究提供更豐富的基礎資料。

1 材料和方法

1.1 實驗用魚

成年黑瑪麗購自山東省聊城市魚友水族館，在本實驗室飼養2周后用于實驗。飼養條件為：魚缸體積約45 L，缸內水溫控制在(26±1) ℃，連續充氣，設定光周期為14 h光照∶10 h黑暗，每天更換缸內水的1/5左右，每天喂食3次冷凍赤蟲Glyceradibranchiata。雄魚體質量為1.51 g±0.47 g，體長為4.73 cm±0.49 cm。

1.2 精液的收集和特征

成年黑瑪麗于本實驗室內進行常年飼養，一年四季均可采集精液。選用性成熟雄魚，用干凈紙巾將魚體表的水擦凈，再用紙巾將魚泄殖孔和生殖肢周圍擦干，輕擠魚腹部兩側擠出精液，用20 μL毛細玻璃管收集精液，并將其轉移到1.5 mL的Eppendorf管內，過程中避免尿液、血液和糞便對精液的污染。每次實驗所用精液樣本來自3尾及以上魚精液的混合。精液為乳白色，充滿著大量的微小顆粒(即精子包)。

1.3 Hank’s平衡鹽溶液及其他溶液的配制

Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)的配制參考Huang等(2004)：NaCl 8.0 g、KCl 0.4 g、CaCl2·2H2O 0.16 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、Na2HPO40.06 g、KH2PO40.06 g、NaHCO30.35 g、C6H12O61.0 g溶于1 000 mL去離子水(Millipore S.A. 67120，Molshem，France)中，pH=7.5，滲透壓為300 mOsm/kg，與精液等滲。不同pH溶液的配制：將配制好的HBSS分成7份，分別用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH滴定調節到pH分別為5、6、7、8、9和10。所有溶液均用去離子水配制。

1.4 精子包形態結構和熒光觀察

用毛細玻璃管收集約8 μL新鮮精液后，立即將其均勻地涂在載玻片上，不蓋蓋玻片在熒光顯微鏡(40×10倍)(BX51，Olympus，日本)下觀察精子包的形態結構，同時進行熒光觀察并攝影。然后，再用移液器滴加適量的去離子水于載玻片上與精液混合均勻，觀察其形態變化。

1.5 精子包破裂和精子運動的觀察

用毛細玻璃管收集6～8 μL新鮮精液后立即轉移到1.5 mL的Eppendorf管內，以1∶10的比例與HBSS(pH=7.5)混合制成精子懸浮液(Huangetal.，2004)。然后，再用精子懸浮液和HBSS(pH=7.5)以1∶50的比例在1.5 mL的Eppendorf管內混合均勻，后用移液器取出20 μL混合液滴在載玻片上，不蓋蓋玻片在顯微鏡下觀察精子包破裂過程和精子運動情況，同時采集照片。為避免精液在載玻片上時間過長而影響精子運動，每隔0.5 h再次將混合均勻的精液用移液器取出20 μL滴在載玻片上另一位置，繼續觀察精子(Levanduski & Cloud，1988)和平均運動速率(Wilson-Leedyetal.，2009)等參數來衡量精子的運動活力。(1)精子運動(向前運動或曲線運動)百分數：在同一視野中，運動精子數占精子總數的百分比。記錄向前運動或曲線運動精子的百分數，原位振動的精子不計(Paniagua-Chavez & Tiersch，2001)；(2)精子運動時間：從精子包完全破裂、精子全部釋放后開始到最終停止運動(運動精子<5%時)的時間(Leach & Montgomerie，2000；Dietrichetal.，2005)；(3)精子運動速率：精子位移與時間之比。

1.6 pH對精子包及精子運動活力的影響

在室溫(20 ℃)條件下，用pH為5、6、7、8、9和10的HBSS分別與精子懸浮液以1∶50的比例在1.5 mL的Eppendorf管內混合均勻，然后立即用移液器取出20 μL混合液滴在載玻片上，不蓋蓋玻片在顯微鏡下觀察在不同pH條件下的精子包破裂過程以及精子運動情況，同時采集照片。為避免精液在載玻片上時間過長而影響精子運動，每隔0.5 h再次將混合均勻的精液用移液器取出20 μL滴在載玻片上另一位置，繼續觀察精子運動情況。通過計算機輔助精子分析(CASA)獲得精子的運動時間、運動百分數和平均運動速率等參數來衡量不同pH對精子運動活力的影響。

1.7 低溫及常溫保存后精子運動情況的觀察

將20 μL精子懸浮液用4 ℃條件下的HBSS(pH=7.5)以1∶50的比例稀釋混勻后，立即用移液器取出20 μL置于載玻片上進行觀察(同時將剩余精子混合液置于4 ℃冰箱)，約5 min精子包開始破裂，約12 min全部破裂。之后每隔0.5 h用移液器再次混勻并快速取出20 μL置于載玻片上持續觀察精子運動情況。其余實驗均在室溫(20 ℃)條件下操作完成，并進行與低溫條件下保存相同時間的觀察和記錄。所有實驗均由相同操作者完成，每項實驗重復3次或以上。

1.8 統計學分析

數據以平均數±標準差表示，以GraphPad Prism 5進行統計學分析，采用t檢驗或方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 黑瑪麗精子包和精子運動的特征

通過擠壓腹部，每次從每尾魚可收集6～8 μL精液，精液呈乳白色，充滿精子包，易沉淀，可能由精子包所致。顯微鏡下可看到精液中含有大量圓形或橢圓形精子包(圖1：A)。用熒光顯微鏡觀察，發現精子包具有自發熒光現象，熒光強度隨觀察時間逐漸減弱直到消失(約持續20 s)，精子包經藍色光激發后綠色熒光減弱，而經綠色光激發后沒有觀察到精子包的紅色熒光現象，經紫外光激發后精子包呈較暗的藍灰色(圖2：A～D)。將新鮮精液與去離子水混合，立即在顯微鏡下觀察，發現精子包形狀有所改變(圖1：B)，有的呈啞鈴形，有的呈長方形，也有的呈不規則形，這可能是由于精子包內外的滲透壓差造成的，但精子包仍完整，未觀察到精子釋放。

圖1 新鮮精液(A)和與去離子水混合后(B)的精子包外部形態Fig. 1 The morphology of Poecilia latipinna spermatophore in fresh semen (A) and mixation with deionized water (B)

圖2 黑瑪麗精子包的熒光特性Fig. 2 Fluorescent characters of Poecilia latipinna spermatophore

A. 明場下的精子包，B. 精子包在藍色激發光下呈現較弱的綠色熒光，C. 精子包在綠色激發光下無紅色熒光現象，D. 精子包在紫外光下呈現較暗的藍灰色

A. spermatophore under bright field，B. spermatophore showed weak green fluorescence under blue exciting light，C. spermatophore displayed no red fluorescence under green exciting light，D. spermatophore appeared dark steel gray fluorescence under ultraviolet light

黑瑪麗具有精子包結構，其精子運動與卵生魚類不同。Tanaka和Oka(2005)將孔雀魚精子包破裂及精子由精子包釋放出的過程分為3個階段。但觀察發現，黑瑪麗精子由精子包釋放出的過程分為4個階段：第一階段，精子包完整，精子未被激活；第二階段，精子包未破裂，精子被激活(此時可觀察到在精子包外周表面有精子頭部在晃動)；第三階段，精子包開始破裂，開始有精子釋放；第四階段，精子包完全破裂，精子全部釋放(圖3：A～D)。

精液用HBSS(pH=7.5)稀釋，孵育約5 min后精子包開始破裂(即第三階段)，這時可觀察到精子陸續從精子包游離出來，且運動速度較快。約12 min后，多數精子包完全破裂，精子全部釋放(即第四階段結束)。脫離精子包的精子很快便停止了運動，但多數精子尾部仍以較快的速度在原位擺動。約經過50 min后，處于HBSS稀釋液中的精子被激活而重新開始運動，并且精子運動的方式和剛從精子包釋放時一樣，在運動過程中都伴隨鞭毛的擺動。

圖3 黑瑪麗精子包的破裂過程Fig. 3 The breakdown process of Poecilia latipinna spermatophore

A. 第一階段，B. 第二階段，C. 第三階段，D. 第四階段

A. the first stage，B. the second stage，C. the third stage，D. the fourth stage

2.2 pH對黑瑪麗精子包及精子運動活力的影響

在室溫(20 ℃)條件下，用不同pH的HBSS分別與精子懸浮液混合，精子包破裂情況不同，精子運動活力也不一樣。在pH為10的HBSS中沒有觀察到精子包破裂和精子釋放，將其精子運動百分數記為0。當精子懸浮液分別用pH為5～9的HBSS稀釋后，均可觀察到精子包破裂和精子運動。在0～0.2 h內為精子包破裂階段，并且在0.2～1 h內精子運動百分數較小，幾乎為0(圖4)。隨時間延長，在pH為6～9的HBSS中，精子運動百分數都有先增加后降低的趨勢(圖4)。但在pH為5的HBSS中，精子運動百分數一直較低，幾乎為0。當pH為7和8時，HBSS中精子運動百分數在各時間段(點)都是最高的(圖4)，并且兩者的運動百分數均值之間的差異無統計學意義(P>0.05)。當pH為7時，精子運動時間要略長于pH為8時，但兩者之間的差異無統計學意義(P>0.05)。并且pH為7和8時的精子運動時間都顯著長于pH為9時(P<0.05)，而與pH為5、6和10時的精子運動時間相比，差異有高度統計學意義(P<0.01)(圖5)。

圖4 pH對黑瑪麗精子運動百分數的影響
Fig.4 The effect of pH on the percentage of motile sperms ofPoecilialatipinna

圖5 pH對黑瑪麗精子運動時間的影響Fig.5 The effect of pH on the motility span ofPoecilia latipinna sperms

a與b、b與c之間的差異有統計學意義(P<0.05)，a與c，以及a、b、c與d之間的差異有高度統計學意義(P<0.01)

There is a significant difference between a and b，b and c (P<0.05)； there is an extreme significant difference between a and c，as well as between a and d，b and d，c and d (P<0.01)

在pH為10的HBSS中，精子包未破裂，精子不運動，運動速率記為0。在pH為5～9的HBSS中，精子平均運動速率最大值都位于時間段5～12 h內(圖6)。在pH為7的HBSS中，精子平均運動速率在大部分時間段內顯著高于在pH為5、6、9和10中的(P<0.05)，而與pH為8中的相比，數值略高，但差異無統計學意義(P>0.05)(圖6)。在不同pH的HBSS中精子平均運動速率都有先增加后降低的趨勢(圖6)。

2.3 溫度對黑瑪麗精子運動活力的影響

用HBSS(pH=7.5)稀釋精液約12 min后，精子包完全破裂，釋放出的精子暫時處于休眠狀態，約經過50 min后，處于HBSS稀釋液中的精子會被激活。因此，在精子由精子包釋放停止運動到精子被激活的期間，精子運動百分數幾乎為0，隨時間延長，精子運動百分數逐漸增大。但約12 h后，精子運動百分數又開始逐漸減小(圖7)。在1～30 h內，室溫(20 ℃)條件下的精子運動百分數大于在低溫(4 ℃)條件下的，而在30 h后，低溫條件下的則又大于高溫條件下的(圖7)。在不同溫度條件下，精子運動時間不同，處于20 ℃和4 ℃條件下HBSS(pH=7.5)中精子的平均運動時間分別約為39 h和58 h，兩者之間的差異有高度統計學意義(P<0.01)。

圖6 pH對黑瑪麗精子平均運動速率的影響Fig.6 The effect of pH on the mean velocity of Poecilia latipinna sperms

精子平均運動速率(在20 ℃或4 ℃下)都有先加快而后減慢的趨勢。在1～18 h內，保存在 20 ℃ HBSS中的精子平均運動速率略高于4 ℃條件下的，而在18 h后，情況則正好相反。在20 ℃的最大平均運動速率為12 μm·s-1(圖8)。

圖7 溫度對黑瑪麗精子運動百分數的影響Fig.7 The effect of temperature on the percentage of motile sperms of Poecilia latipinna

圖8 溫度對黑瑪麗精子平均運動速率的影響Fig.8 The effect of temperature on the mean velocity of Poecilia latipinna sperms

3 討論

與體外受精的硬骨魚類相比，體內受精的黑瑪麗精子在形態結構、生理特性，及運動規律等都有顯著差異。在形態結構方面，體外受精的魚類精子頭部近似于球形，線粒體集中分布在頭后部。而體內受精的魚類精子頭部為細長形，線粒體圍繞尾最前段分布，這與哺乳動物有些類似(Stoss，1983)。在糖代謝活性等方面，體內受精的魚類精子也與哺乳動物更為類似(Kallman，1975)，這可能與精子持久運動和能量代謝的特殊需求有關。體內受精的魚類，如劍尾魚在精子發生過程中形成了精子包結構，交配時雄魚將精子包傳輸到雌魚體內，并可在雌魚體內儲存長達幾個月，其中的精子一直保持授精能力(Yangetal.，2006)。這可能與精子包特性和精子所處環境的pH和溫度等因素有重要關系。

3.1 黑瑪麗的精子包和精子運動特征

體內受精的魚類精子包與節肢動物、有尾兩棲類及軟體動物等的精莢或精包有所不同。部分體內受精魚類，如孔雀魚精子包是在精子發生過程中逐漸形成的，而不是像其他動物的精莢或精包那樣在精子發育(基本)完成后再由其他腺體來源的物質粘接或包裹形成。另外一個特點是部分體內受精魚類精液中的精子包在交配過程中隨精液一起被輸送到雌性體內，而不是像其他動物的精莢或精包那樣以固形物的形式靠非液體的機械作用送到雌性體內。在中文文獻中尚未見到對體內受精魚類精子包的具體闡述，也未見對其專門命名。這里對這一特殊結構及其在適當溶液中的破裂過程作了初步研究，并把其名稱初步定為“精子包”，以與其他動物的精莢、精包等區別。

觀察發現，黑瑪麗的精子包破裂和精子運動都需要在適當稀釋液(或雌性體液)中實現，用HBSS(pH=7.5)對黑瑪麗精液進行稀釋，約5 min后，精子包開始破裂，精子從精子包外周各個方向游離出來，有的精子頭部還披有精子包膜。精子包中不同部位的精子從精子包釋放的位置和時間是不同的，可能與精子在精子包內的分布有關，排列在精子包內表面的精子先釋放出來；也可能與精子的質量有關，質量較高的精子被激活后運動活力較強，能夠先于質量較低的精子以較快的速度游離出來。將黑瑪麗精子從精子包中釋放出來的過程分為4個階段，這樣就可以對精子包從開始進入稀釋液到精子完全釋放的整個過程更好地了解和描述。另外，黑瑪麗精子包的自發熒光現象和其形態特征很可能有利于進一步對其性腺的發育和精子的發生過程進行組織學方面的研究。

在黑瑪麗精子包破裂和精子釋放過程中發現一種特殊現象，大多數精子由精子包釋放后就停止了運動，只有一些精子的尾部仍在擺動，約經過50 min后精子會再次運動起來，幾十小時后最終又停止了運動，這種現象尚未見到有關報道。一般說來，體外受精的魚類精子一旦被激活運動后，精子的運動時間很短暫，通常只有幾秒到幾分鐘。但是體內受精的魚類精子在HBSS中的運動時間在室溫下可維持1 d，4 ℃下可持續幾天(Huangetal.，2004；Yang & Tiersch，2009)。不同物種的精子在結構和生理上的差異可能是造成精子運動時間不同的主要原因。體內受精的魚類精子在形態上與哺乳動物的精子形態更加相似，且可以在雌性生殖道的液體中運動幾十小時(Yang & Tiersch，2009)。尖嘴魚Syngnathusabaster精子在水中可以運動5 min，而在卵巢液中的運動時間可超過25 min(Dzyubaetal.，2008)。體外受精魚類的精子在水中運動，而體內受精魚類或哺乳動物的精子是在生殖道液體內運動，2種魚類精子運動環境明顯不同，這可能是導致 2種魚類精子運動時間明顯不同的重要原因。本實驗中黑瑪麗精子從精子包釋放后，由于精子包內外的滲透壓、pH、離子成分、營養成分等發生了變化，精子需要在新環境條件下適應后才能被再次激活。或者像哺乳動物的精子獲能過程那樣，由于在沖破精子包游離出的過程中精子表面粘上了某種(些)物質需要一定時間去除。也許是精子到達外界環境時需要吸收利用HBSS(pH=7.5)(或雌性體液)中的葡萄糖分解產生ATP，而后才能開始真正的前進式運動。精子靜止一段時間后再次運動可能對保證其正常的運動活力和受精能力具有重要意義。但是，目前尚不清楚在雌魚體內精子是否也靜止一段時間之后再開始運動。另外，再次運動的精子和剛從精子包中游離出的精子相比，哪類精子更容易讓卵子受精，以及其受精能力有何不同等問題也有待進一步研究。

3.2 pH對黑瑪麗精子包和精子運動活力的影響

當pH為5時，盡管精子包可以破裂，但精子運動百分數一直都很低。而pH為10時，精子包不能破裂。這可能是由于強酸強堿不利于精子包破裂，精子不能被正常釋放出來。即使能夠被釋放出來，在強酸強堿溶液中精子的正常生理過程也無法實現。當pH為7～8時，黑瑪麗精子的運動百分數、平均運動速率和運動時間都較高(長)，而且在pH為7或8下精子的運動百分數、平均運動速率和運動時間的差異均無統計學意義，這表明中性至弱堿性環境最適于黑瑪麗精子運動。適宜的pH可以增加精子運動百分數、提高精子平均運動速率、延長精子運動時間。這與對體外受精的玫瑰無須鲃Puntiusconchonius精子研究結果(李紀同等，2012)相似。另外，虹鱒Oncorhynchusmykiss(Wojtczaketal.，2007)和波斯鱘Persiansturgeon(Alavietal.，2004)等體外受精的魚類精子也是在弱堿性溶液中各項運動參數值最大。

3.3 溫度對黑瑪麗精子運動活力的影響

Huang等(2004)報道了綠劍尾Xiphophorushelleri精子在室溫下的HBSS中能維持運動24 h，而在4 ℃條件下卻能運動10 d。本實驗中黑瑪麗精子在低溫(4 ℃)條件下約為58 h，而在室溫(20 ℃)條件下運動時間約為39 h。在同一溫度條件下，黑瑪麗和綠劍尾的精子運動時間存在較大差別，可能是由于不同物種的精子運動特性所致。但本實驗也足以說明低溫條件可以顯著延長黑瑪麗精子的運動時間，這與前述報道是一致的。在20 ℃下精子的運動百分數和平均運動速率在開始一段時間內要顯著高于4 ℃，而后來又低于4 ℃。這可能是由于在高溫條件下精子的新陳代謝旺盛，線粒體產能較快較多，能量消耗也更快，對精子的細微結構及大分子等的損傷也快，因此精子的運動百分數和平均運動速率在一段時間后變得低于低溫環境條件。Gardiner(1978)報道了孔雀魚和海鯽魚Cymatogasteraggregata的精子能夠代謝細胞外的葡萄糖，Dong等(2006)報道在HBSS中加有適量的葡萄糖對劍尾魚精子保持較高的運動活力是必不可少的。本實驗中所用的HBSS稀釋液中也加了葡萄糖，但是黑瑪麗精子在運動過程中對葡萄糖的利用情況還有待進一步的研究。