外泌體研究進展及未來的應用與挑戰*

于廣鑫 曾婉嘉 魯鳳民

（北京大學基礎醫學院病原生物學系 北京 100191）

1 外泌體簡介與發現、發展歷程

外泌體是細胞外囊泡（extracelulav vesicle，EV）中最小的一種，直徑約為30～150 nm，由晚期內體／多囊泡體（multivesicular body，MVB）與質膜融合后釋放到細胞外環境中。早在1983年，Clifford Harding［1］和Bin-Tao Pan［2］利用抗轉鐵蛋白受體抗體可視化的方法，分別在大鼠和綿羊網織紅細胞中，觀察到這種經由多囊泡內體（也稱多囊泡體）與質膜融合而釋放的小囊泡，隨后Rose M.Johnstone［3］將之稱為“外泌體”。外泌體一開始被認為是細胞排泄細胞碎片和過時廢物的一種形式，直到1996年，Graqa Raposo［4］發現衍生自人和鼠B 淋巴細胞的外泌體可以誘導抗原特異性MHC Ⅱ類限制性T 細胞應答，證實外泌體參與細胞的免疫過程。外泌體領域的一次重要突破在于發現外泌體可以攜帶 mRNAs、微小RNA（mircroRNAs，miRNAs）［5］和線粒體RNA［6］等核酸內容物并在細胞間相互傳遞。這一發現引發了外泌體領域的研究熱潮。2013年，美國科學家James E.Rothman 和Randy W.Schekman，德國科學家Thomas C.Südhof 因為發現細胞內部囊泡（包括外泌體）運輸調控機制而榮獲諾貝爾獎。

2 外泌體的產生及分泌

圖1 外泌體產生與分泌（參考自文獻［9，10，12］）

外泌體的產生需要經歷以下過程：細胞外物質被細胞膜包裹并向內凹陷形成早期內體，早期內體在遷移和成熟過程中，內體膜向內凹陷并將胞質中的細胞物質包裹，形成攜帶核酸、蛋白質和其他代謝物質等內容物的管腔內囊泡（ILV），進而轉化成內含多囊泡的晚期內體，也稱多囊泡體。內體分選轉運復合體（ESCRT）及其相關蛋白或輔助因子，例如腫瘤易感基因101 蛋白（TSG101）、液泡蛋白分選因子（Vsp4）和Alix 蛋白等在此過程發揮了重要作用［7-8］。此外，涉及脂質、中性鞘磷脂酶、跨膜4 超家族成員9（TM4SF9）、熱休克蛋白（HSP）等非ESCRT 依賴的外泌體產生途徑也被相繼提出［9-10］。之后，MVB 與細胞膜融合，這些管腔內囊泡釋放到細胞外環境中形成外泌體。Rab GTP酶家族成員，尤其是Rab27a 和Rab27b，調控了該過程的進行［11］。隨后外泌體利用膜融合、內吞，以及識別和結合細胞表面特異性受體，將內容物遞送至靶細胞。

3 外泌體的生理病理功能

外泌體可由免疫細胞、神經細胞和干細胞等多種類型細胞分泌，同時具有不同的生理功能，例如抗原呈遞［13］、RNA 傳遞［14］及組織修復［15］等。作為細胞間重要的通訊工具，外泌體攜帶了豐富的生物活性物質，例如DNA，mRNAs，miRNAs 和蛋白質等。這些物質在脂質雙分子層的保護下，可以相對穩定地存在于細胞外環境中，因此，其不僅能作用于鄰近的細胞，還可通過體液運輸進入遠端的靶細胞，履行其作為生理和病理信號載體的功能［16］。有研究顯示，外泌體可以介導神經元與神經膠質細胞之間的相互作用，從而調節軸突生長和突觸形成［17］。除了參與正常的生理活動，外泌體還與疾病進展有關。腫瘤細胞分泌的外泌體不僅可以影響局部的腫瘤微環境，促進血管形成和腫瘤細胞增殖，還能經長距離運輸到達遠端，增強血管形成并誘導內皮細胞和基質細胞分化，形成適合腫瘤轉移定植的微環境［18］。此外，外泌體可以將腫瘤抗原呈遞給樹突狀細胞，誘導免疫應答［12］。但其也能誘導活化的細胞毒性T 細胞凋亡、減少自然殺傷細胞增殖能力或促進調節性T 淋巴細胞的分化，從而發揮免疫抑制作用［19］。

4 外泌體的未來應用

外泌體可以攜帶核酸、蛋白質等物質進出細胞。幾乎所有體液中都有外泌體的存在，包括唾液、母乳、血液、滑液、羊水、尿液、精子和卵泡液等［20］。不同疾病患者從細胞釋放到循環系統及泌尿系統中的外泌體，其所含脂質、蛋白質和RNA 水平有明顯差別，這使得血液或尿液等來源的外泌體可以作為多種疾病的潛在診斷標志物［21-22］。多項研究表明，從血清中分離的外泌體擁有作為胰腺癌［23］、多形性膠質母細胞瘤［24］、胃癌［25］、神經系統疾病［26-27］等疾病診斷標志物的潛力，而尿液中的外泌體已作為生物標志物的材料來源，用于腎臟、泌尿系統及全身性疾病的診斷［21，28］。相對于組織樣本的難獲取和難重復性，利用外泌體來源的生物標志物進行疾病的檢測，是一種準確、無創且成本效益更優的診斷方法。

除用于疾病診斷外，良好的生物相容性、循環穩定性、生物屏障滲透性、低毒性和低免疫原性，使得外泌體具有作為藥物載體的潛力。利用外泌體進行基因編輯工具的遞送，也是科學家關注的熱點。例如在體外將過氧化氫酶加載到外泌體中，通過鼻腔給藥到達急性腦炎小鼠模型腦部，使神經元存活數量提高3 倍［29］。Kim 等［30］通過電穿孔方法將CRISPR／Cas9 表達質粒注入外泌體中，可有效遞送CRISPR／Cas9 系統，進而實現對靶細胞的基因編輯，這一發現揭示了外泌體在遞送CRIPSR／Cas9系統中的潛在價值。與Kim 等的研究類似，Lin 等［31］將外泌體和脂質體孵育，開發了一種外泌體-脂質體雜合的類脂質體，并成功通過這種雜合類脂質體遞送CRISPR-Cas9 表達質粒。此外，也有研究者通過在Cas9 蛋白上融合2 ～4 個NEDD4家族蛋白的WW 結構域，使Cas9 蛋白能被選擇性地募集到抑制蛋白結構域蛋白1（arrestin domain containing protein 1，ARRDC1）介導的微泡［ARRDC1-mediated microvesicles（ARMMs）］上［32］，或者在供體細胞中過表達水泡性口炎病毒的糖蛋白

（glycoprotein of the vesicular stomatitis virus，VSVG），使細胞能夠產生攜帶gRNA 和Cas9 蛋白的囊泡［33］。這些外泌體遞送基因編輯系統的研究，均極大地推動了CRISPR-Cas9 應用于臨床的進程。相對于人工合成的納米載體而言，外泌體在結構和組成上與細胞膜更相似，具有足夠時長的循環半衰期，并且可以穿透組織深處并逃避免疫系統的清除，是一種很有應用前景的遞送工具。此外，通過人工修飾外泌體以增加其靶向性，是當下外泌體遞送策略的研究重點之一。這種靶向性可以通過在親本細胞中導入表達靶向配體和跨膜蛋白域的融合質粒完成，也可以對外泌體表面進行靶向抗體的涂覆［34-35］。

5 外泌體研究面臨的挑戰

盡管外泌體在疾病診斷及藥物遞送方面表現出了令人興奮的應用前景，但仍有一些問題需要注意。首先，如何提升內容物檢測的靈敏度和特異性，是外泌體作為生物標志物必須跨越的障礙。其次，血漿和尿液里的外泌體來源于多種組織細胞，如何通過外泌體的特異性表型特征，對其來源細胞進行鑒定，以更好地解讀外泌體攜帶的信息仍需進一步探索。此外，樣本中包含有很多與外泌體相似的組分，例如細胞碎片、其他細胞外囊泡等，隨著外泌體研究的發展，現有分離技術已經不能滿足研究的需要，開發更為高效的外泌體分離技術，才能在外泌體領域進行更深入的探索。最后，作為藥物靶向載體，優化出更為高效的藥物加載方式，以及精確、無副作用的靶向裝置，是保證治療成功的關鍵所在。