藏藥十五味云鵬散含汞制劑和無汞制劑對急性痛風性關節炎大鼠的影響*

紅梅，李先加，劉有菊，普措多杰

(1.藏藥新藥開發國家重點實驗室，青海省藏藥新藥開發重點實驗室，青海省藏醫藥研究院，西寧 810016；2.青海大學藏醫學院，西寧 810001)

痛風是由于嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄障礙引起血尿酸增高的代謝性疾病，急性痛風性關節炎(acute gouty arthritis，AGA)是其最常見首發癥狀。主要表現為反復發作的關節紅腫熱痛，嚴重可導致關節功能障礙。AGA是痛風的典型表現形式[1]，受累關節出現紅、腫、熱、痛，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和前列素E2(prostaglandin E2, PGE2)等炎癥因子增加，產生關節軟骨的炎癥損傷，誘導基質降解，導致疼痛、腫脹等，從而破壞關節，導致關節畸形及功能障礙[2-3]。研究表明，體內尿酸鈉鹽晶體作用于血小板、中性粒細胞、滑膜細胞、單核細胞，刺激這些細胞釋放多種炎癥遞質，如Ca2+、PGE2等， 這些炎性細胞因子通過自分泌和旁分泌在痛風發病的過程中發揮重要作用[4]。很多經典藏藥制劑對痛風有獨特療效，筆者在藏醫理論的指導下，通過查閱藏醫藥文獻，從眾多藏醫藥古方中篩選出藏藥十五味云鵬散(sPos Khyung bCo lNga)[5]，其方源《藏醫治療寶庫》有近800年的臨床用藥歷史，其方源《貢珠藏醫紀要及其注釋》中十五味云鵬散有2種方劑，一種無汞炮制品制劑由乳香、決明子、黃葵子、巴夏嘎、訶子、毛訶子、木香、余甘子、寬筋藤、渣馴膏、藏菖蒲、兒茶、安息香、生烏頭、麝香等藥材組成，另一種是含汞炮制品制劑，由乳香、決明子、黃葵子、巴夏嘎、毛訶子、余甘子、寬筋藤、渣馴膏、藏菖蒲、兒茶、安息香、生烏頭、麝香、水銀熱制炮制品、西藏貓乳等藥材組成[6]。藏文名布瓊覺安。十五味云鵬丸是藏醫治療關節疼痛、腫脹、關節腔積水、皮疹、皮膚瘙癢諸證的古方，至今已有一千多年的歷史?，F有的資料只是該藥治療疾病的臨床研究總結，實驗研究尚少。筆者在本實驗觀察十五味云鵬散含汞或無汞制劑對AGA及相關炎癥因子的影響變化，以期為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1藥品及試劑 本實驗中所用十五味云鵬散有含汞制劑和無汞制劑兩種制劑。十五味云鵬散含汞制劑含水銀炮制品40 mg·g-1生藥，無汞制劑未添加水銀炮制品，產品批號均為20150305，由青海大學藏醫學院提供；秋水仙堿片，云南昊邦制藥有限公司生產，批號：141120，規格：0.5 mg；尿酸鈉，美國SIGMA-ALDRICH公司產品，批號：BCBF1330V；TNF-α、IL-1β、PGE2德國國際品牌聯盟(INTERNATIONAL BRAND LEAGUE，IBL)試劑盒，購于上海郁溪生物科技有限公司。

1.2儀器 JD1060-2電子天平，感量：0.1 g，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；TDL-5離心機，上海安亭科學儀器廠；SpectraMaxI3多功能酶標儀，美國MD公司。

1.3動物 無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠70只，體質量130～150 g，5周齡，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養條件：溫度18～22 ℃，相對濕度：45%～50%，自然光照，排氣扇通風。

1.4尿酸鈉溶液的制備 稱取尿酸鈉2500 mg，充分研磨，加0.9%氯化鈉溶液100 mL，同時加溫攪拌成25 mg·mL-1尿酸鈉混懸液[7]。

1.5分組與給藥 將健康SPF級SD雄性大鼠70只適應性喂養1周，稱體質量，簡單隨機法分為空白對照組，模型對照組，秋水仙堿片組，十五味云鵬散含汞制劑大、小劑量組及無汞制劑大、小劑量組，每組10只。根據人與動物給藥劑量換算方法，十五味云鵬散含汞制劑和無汞制劑大、小劑量組給藥劑量分別為0.28，0.07 g·kg-1、秋水仙堿片組給藥劑量0.6 mg·kg-1。將藥物溶于純凈水，配制成相應濃度藥液?？瞻讓φ战M、模型對照組給予相應體積純凈水，造模同天開始灌胃給藥，連續5 d。

1.6AGA大鼠模型的制備[8]大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，50 mg·kg-1。用記號筆在大鼠右后肢踝關節周圍標記，局部乙醇消毒，大鼠右踝關節擺放成直角，充分暴露踝關節與脛腓骨之間間隙，以45°夾角穿向大鼠右后肢背側正中踝關節與脛腓骨之間關節腔，將25 mg·mL-1尿酸鈉溶液0.2 mL注入踝關節腔，以關節囊對側鼓起為注入標準，即成大鼠AGA模型。 空白對照組以0.9%氯化鈉溶液代替尿酸鈉溶液。

1.7關節腫脹度的測量 造模前，造模后24，48，72 h分別在大鼠右后足踝關節上方1.0 cm 處用編號筆作一橫線標記，無彈性軟皮尺測量大鼠受試踝關節相同部位周徑，測注射后不同時間踝關節周徑，每次重復測量3次，取平均值。關節腫脹度=造模后關節周徑-造模前關節周徑[9]。

1.8血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量測定 造模第5天，末次給藥后1 h處死大鼠，取腹主動脈血2 mL，3000 r·min-1離心10 min(r=10 cm)，分離血清，保存，備用。按ELISA試劑盒操作說明書，繪制標準曲線，測定血清細胞因子TNF-α、IL-1β、PGE2含量[9]。

2 結果

2.1大鼠足踝關節腫脹程度 造模后24～72 h，模型對照組踝關節腫脹度較空白對照組明顯增加(P<0.01)。與模型對照組比較，造模后24～48 h，十五味云鵬散含汞制劑(大劑量組48 h除外)和無汞制劑各劑量組受試足踝關節腫脹度均明顯降低(P<0.05)；造模72 h后明顯降低，但差異無統計學意義，見表1。

2.2血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量 與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量明顯升高(P<0.05)；與模型對照組比較，十五味云鵬散含汞制劑大、小劑量組大鼠血清IL-1β、PGE2顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，無汞制劑大劑量組血清PGE2顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 7組大鼠不同時間踝關節腫脹度測定結果

組別劑量/(g·kg-1)24 h48 h72 h空白對照組—-0.18±0.16-0.16±0.13-0.16±0.13模型對照組—0.88±0.35?10.66±0.38?10.42±0.42?1秋水仙堿片組0.00060.52±0.24?20.28±0.24?20.22±0.23十五味云鵬散含汞制劑 小劑量組0.070.56±0.16?20.31±0.17?20.18±0.36 大劑量組0.280.55±0.21?20.38±0.210.21±0.15十五味云鵬散無汞制劑 小劑量組0.070.57±0.19?20.33±0.14?20.19±0.14 大劑量組0.280.54±0.14?20.28±0.17?20.15±0.18

與空白對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05

表2 7組大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量測定結果

Tab.2DeterminationresultsoftheserumlevelsofTNF-α,IL-1βandPGE2insevengroupsofrats

組別劑量/(g·kg-1)IL-1βTNF-αPGE2空白對照組—6.38±1.3778.68±16.71104.78±17.63模型對照組—8.10±1.78?198.19±20.78?1138.62±40.77?1秋水仙堿片組0.00066.70±0.38?282.69±10.12?298.09±23.89?2十五味云鵬散含汞制劑 小劑量組0.076.72±0.90?283.77±21.7196.71±24.07?2 大劑量組0.286.64±0.37?281.56±14.2292.08±15.99?3十五味云鵬散無汞制劑 小劑量組0.078.20±2.2286.35±20.91120.81±48.97 大劑量組0.286.73±1.3685.59±10.9196.58±33.71?2

與空白對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with blank control group，*1P<0.05，;compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

3 討論

研究表明，炎癥細胞招募與內皮細胞激活所引發的炎癥因子IL-1β和 TNF-α 等釋放和炎癥反應，在AGA 疾病過程中起重要作用[10-11]，AGA發作的特征性表現為關節滑液內中性粒細胞募集反應[12]。尿酸鈉晶體被單核吞噬細胞攝取后可誘導IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子及炎癥趨化因子生成，導致單核吞噬細胞、中性粒細胞及其他炎癥細胞聚集于炎癥部位，觸發炎癥級聯反應[13]。臨床一般采用秋水仙堿、非甾體抗炎藥或糖皮質激素治療AGA， 但這些藥物均無法避免變態反應、中毒、骨髓抑制、肝腎損害等不良反應。十五味云鵬散具有消炎止痛作用，用于關節紅腫疼痛、發癢等癥，臨床治療效果明確[14-15]。本實驗結果表明，十五味云鵬散含汞制劑和無汞制劑均能顯著降AGA模型大鼠踝關節腫脹度，該藥理作用可能與本方中安息香、生烏頭、兒茶、藏菖蒲、麝香的消炎、止痛、斂黃水作用有關[16]；曾煦欣等[17]研究發現，余甘子甲醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位為余甘子抗炎鎮痛的有效部位，其中以甲醇與正丁醇部位作用最強，推斷余甘子治療AGA的主要機制是抑制炎性遞質PGE2和TNF-α釋放。本實驗發現小、大劑量含汞制劑明顯能降低AGA大鼠血清IL-1β、PGE2水平，并存在量效關系；本實驗結果還表明，無汞制劑只有大劑量組PGE2水平顯著降低。與模型對照組比較，對IL-1β、TNF-α細胞因子的影響無統計學意義；提示十五味云鵬散含汞制劑較無汞制劑能更明顯抑制AGA模型大鼠血清IL-1β、PGE2水平，這可能因為含汞制劑中配用了特殊炮制的名貴藥材汞炮制品，并且汞炮制品具有祛風、化毒、療瘡等顯著效果[18]，起到了增強藥效、快速降低或抑制炎癥因子分泌作用，可緩解癥狀，從而有效治療AGA。