生化藥注射劑的質量評價策略與技術要點*

鄭璐俠，史芳亮，呂晶，張穎，邵泓，陳鋼

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

生化藥品是指從動物器官、組織、體液、分泌物中經前處理、提取、分離、純化等制得的安全、有效、質量可控的藥品，主要包括蛋白質、多肽、氨基酸及其衍生物、多糖、核苷酸及其衍生物、脂、酶及輔酶等。生化藥注射劑是注射劑中較特殊的一類，按照化學藥品質量控制方式很難控制其質量，與普通化學藥品注射劑相比具有以下3個特殊性：①原材料大多來自生物體，來源復雜，組成不明確，本身具有不均一性，結構確證難；②生產涉及器官、組織、體液、分泌物的提取、分離和純化等過程，僅通過終產品的質量標準很難有效控制質量；③生化藥品需用效價測定、體外細胞活性實驗、生物檢定法等生物分析技術證實其生物活性，比理化測定具有更大的可變性。2017年度《國家藥品不良反應監測年度報告》顯示，按照給藥途徑統計，2017 年藥品不良反應/事件報告中，靜脈注射給藥占61.0%，其他注射給藥占3.7%，口服給藥占32.0%，其他給藥途徑占3.3%。與2016 年相比，靜脈注射給藥占比上升1.3%，其中有多個生化藥注射劑被提及，包括復方氨基酸(18AA) 、脂肪乳、丙氨酰谷氨酰胺和門冬氨酸鉀鎂等[1]。

近年來，隨著藥品監管體制改革的深入推進，國家有關部門陸續出臺了一系列與生化藥注射劑相關的新法規和政策。2008年1月8日，國家食品藥品監督管理局頒布了《多組分生化藥注射劑基本技術要求(試行)》，提出了多組分生化藥注射劑審評中的重點關注點和相應的技術要求。2017年3月16日，國家食品藥品監督管理總局(CFDA)藥品審評中心發布了藥品生產質量管理規范(good manufacturing practices,GMP)生化藥品附錄，作為《藥品生產質量管理規范(2010年修訂)》配套文件，旨在對生化藥品的監管制定更具體、更嚴格的監管措施。2017年10月8日，中共中央辦公廳國務院辦公廳印發了《關于深化審評審批制度改革鼓勵藥品醫療器械創新的意見》，明確要求嚴格注射劑藥品審評審批和開展藥品注射劑再評價。2017年12月22日，CFDA 藥品審評中心組織起草了《已上市化學仿制藥(注射劑)一致性評價技術要求(征求意見稿)》，明確了化學仿制藥(注射劑)一致性評價的范圍和技術要求?；谶@樣的時代背景，筆者針對生化藥注射劑這一類特殊的高風險品種進行質量評價策略和研究要點討論，以期為提升生化制藥行業整體水平和藥品質量提供借鑒和參考。

1 生化藥注射劑現狀

《中華人民共和國藥典》2015年版共收載生化藥注射劑67個，主要包括5大類：①氨基酸類，如復方氨基酸注射液等；②多肽、蛋白和酶類，如縮宮素注射液、注射用烏司他丁、注射用門冬酰胺酶等；③多糖類，如肝素鈉注射液等；④核苷類，如注射用阿昔洛韋等；⑤多組分類，如垂體后葉注射液等。目前，國內生化藥注射劑主要存在如下問題。

1.1同一品種批準文號過多 我國已批準的部分生化藥注射劑品種的注冊文號，存在同一品種有幾十甚至上百個文號現象。如利巴韋林注射液，221家企業共有276個批準文號。根本原因在于主要以仿制為主，大多是低水平重復申報，長期存在同質化嚴重、產能過剩和惡性競爭現象，影響產品質量。還有一些生化藥注射劑品種存在只占用文號，并不實際生產的現象，如注射用抗乙肝免疫核糖核酸，30家企業擁有40個批準文號，但調研后發現，近年內沒有一家生產。

1.2立題合理性不足 生化藥注射劑的立題合理性表現在更改劑型上。如在醋酸奧曲肽注射液的質量研究中發現，注射用醋酸奧曲肽與醋酸奧曲肽注射液相比，有關物質含量較高，穩定性較差，基本不含醋酸鹽，生產工藝較繁雜，生產成本與風險也較高，且原研企業無此劑型，劑型的合理性需要進一步論證[2]。

1.3處方工藝與原研不一致 國內注射劑仿制藥中成鹽形式或輔料種類、用量與原研不符的現象較常見，在生化藥注射劑中也有體現。如在注射用胸腺法新的質量研究中發現，原研藥為胸腺法新的醋酸鹽，但國內部分企業生產的樣品中未檢出醋酸鹽，與原研藥不一致，其成鹽穩定性需要進一步考察論證。國內部分企業制劑處方中甘露醇用量明顯低于原研制劑，非等滲溶液，易加劇注射部位不適；還易導致樣品水分升高，增加質量隱患，應對處方合理性進行再確認。

1.4標識規格與實際生產不符 生化藥品的標識規格多與常規化學藥一致，以質量計，但其實際生物活性往往需采用效價單位表示方法(即U·mg-1)，來反映生化藥品單位質量中具有的生物活性高低。筆者在硫酸魚精蛋白注射液的質量研究中發現，雖然該注射液標識規格為5 mL：50 mg或10 mL：100 mg，但國內制劑生產企業實際生產時按效價投料，并非按質量投料。具體來說，就是國產硫酸魚精蛋白原料的效價水平可以達到140～150 U·mg-1，而制劑生產時是按照每毫克硫酸魚精蛋白中和肝素100 U的效價進行投料折算，則規格為5 mL：50 mg的注射液實際投入硫酸魚精蛋白33～36 mg，僅相當于標示量70%。隨著企業生產工藝的提高，如果所生產或使用的原料效價提高，那么投入相同效價所需原料的質量就會相應地進一步減少。因此，該制劑并未達到規格所標識的主成分質量，與進口制劑標識的相同規格實際上存在差異。

1.5源頭質量控制薄弱 《中華人民共和國藥典》2015年版收載的常見生化藥品既有來源于豬、牛、羊臟器及人尿液等，還有魚成熟精子、牛血清等，這些原材料收集、處理、保存等基本不在藥廠完成，不符合GMP管理要求，但其來源和質量優劣又是決定后續生化藥品質量非常重要的關鍵點。如在鹿瓜多肽注射液的質量研究中，本實驗室以核酸分子鑒定技術為基礎，建立了鹿骨中梅花鹿及馬鹿源性成分的鑒別方法[3]，在部分企業的鹿骨原材料中除梅花鹿成分外同時檢出馬鹿成分，提示該企業鹿骨原材料有被馬鹿源性成分混雜或污染的情況，其制劑存在潛在風險。

1.6物質基礎不明，質量有待提高 生化藥注射劑尤其是多組分生化藥注射劑，由于來源復雜，提取物大多物質基礎不明確，部分品種結構上具有異質性，尚無法達到批間完全一致性。生產企業往往以產品達到現行國家標準為主要目的，進行質量標準研究和提高的主動性較差，重視程度不高。這些原因均導致生化藥注射劑質量標準很難真實反映產品間差異，整體質量標準水平有待完善。如筆者在注射用核糖核酸質量研究中發現，現行標準中缺少對核糖核酸片段長短、雜蛋白和苯酚殘留的控制要求，從而會影響標準中紫外吸收系數法測定含量結果的準確性，有必要對質量標準進行提高[4]。

1.7包材質量存在隱患 藥品包材是藥品不可分割的組成部分，直接關系藥品質量。玻璃是注射劑最常用的包裝材料之一。基于成本等因素考慮，我國注射劑藥用玻璃包裝材料多數以鈉鈣玻璃和低硼硅玻璃為主，與國際上采用的中性玻璃的質量存在差距[5]。筆者對6家生產企業的注射用胸腺法新的包材玻璃中13種常見元素遷移和基于膠塞配方對其中的酚類有機化合物遷移進行考察，研究顯示，有2家產品分別出現了抗氧劑二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)和硫化劑對特辛基苯酚向藥品遷移的現象，包材質量有待提高。

2 生化藥注射劑的評價策略

美國食品藥品管理局(FDA)對“一致性”的定義為：活性成分、劑型、規格、給藥途徑和適應證與參比制劑一致。FDA橙皮書共收載生化藥注射劑22個品種(表1)。國內已上市的生化藥注射劑既有FDA橙皮書上已收載的仿制藥，也有一些根據中國國情開發的國外沒有的特殊生化品種。因此，與化學藥品注射劑的評價策略不盡相同，筆者認為，不應統稱為一致性評價，而是應該根據品種的特點，進行一致性評價或再評價(圖1)。

對于其中結構明確、物質均一、相對分子質量較小的化合物，如果有完整的安全和有效性數據或被FDA橙皮書收載，如右旋糖酐鐵、更昔洛韋、鹽酸精氨酸注射液等，應按照化學藥品注射液要求進行一致性評價執行。否則應進行再評價，如肝水解肽注射液，雖然相對分子質量不大，但由于物質基礎不明確，則應進行再評價。對于相對分子質量較大的化合物，如蛋白、多糖、酶等藥物，如果結構明確，有完整的安全和有效性數據或被FDA橙皮書收載，如胰島素、卵泡刺激素、肝素鈉注射液等，可進行一致性評價，否則也應進行再評價。

對于結構不明確，物質基礎不一致，又沒有完整安全和有效性數據，同時也不在FDA橙皮書中的生化藥注射劑，是否值得進行再評價，筆者認為關鍵在于臨床是否有效。生產企業應該客觀評價自身產品并進行薈萃分析，即在世界范圍內收集對某一疾病療效的小樣本，以及單個臨床試驗的結果，對其進行系統評價和統計分析。如果有效，可以繼續做藥學再評價等，否則建議放棄。需要強調的是，對于那些結構不明確的生化藥注射劑，只要臨床有效就值得去堅持，如胰島素注射劑，該品種的發現和臨床應用已有近百年歷史，但在臨床剛開始使用時純度并不高，人們對其結構亦不清楚，從1921年首次提取到胰島素應用于臨床，一直到20世紀80年代初才運用重組技術生產高純度人胰島素，中間經歷了60多年時間，現在對其結構已經掌握到可以進行改構的程度，以根據實際需求達到快速起效或緩釋的作用。這就是一個典型生化藥走過的歷程，從發現、提取、結構確認，到高純度、最后可以按需改構，支撐它走完這一歷程的重要因素就是臨床療效。

表1 FDA橙皮書上收載的生化藥注射劑品種

RX表示處方藥；DISCN表示停用藥物

RX, prescription drug products; DISCN, discontinued drug products

圖1 生化藥注射劑的評價策略

Fig.1Evaluationstrategyofbiochemicalinjection

3 生化藥注射劑質量評價的藥學研究要點

根據《多組分生化藥注射劑基本技術要求(試行)》和《GMP生化藥品附錄》的要求進行歸納總結，生化藥注射劑的藥學研究要點主要有以下4點。

3.1劑型及規格的合理性 劑型的選擇主要考慮藥物的理化性質、穩定性和生物學特性，以及臨床治療的需要和臨床用藥的順應性。此外，還要考慮工業化生產的可行性等因素。規格則是根據臨床研究確定的用法用量，從方便臨床用藥、滿足臨床用藥需要的角度設定，同時隨著臨床進一步的研究結果進行必要的調整。對于FDA橙皮書收載的生化藥注射劑品種，應注意與橙皮書標識的參比制劑(reference standard，RS)保持一致。

3.2制備工藝研究 要確保與病毒傳染有關的動物來源的生化藥品的安全和質量，僅靠成品的質量標準不能完全控制此類產品的質量，必須從源頭開始進行全程的嚴格控制，將原材料、中間體的質控作為質量標準的一部分。需要采用組合的方法，包括原材料的篩選、檢疫和檢測，提取純化和病毒滅活(去除)工藝的驗證，以及GMP的過程控制。在制劑處方及制備工藝研究中，因為生化藥多存在性質不穩定、加熱易破壞的問題，重點應確保生化藥物理化學穩定性和生物活性。

3.3病毒滅活/去除工藝驗證 生化藥原材料來源于不同動物組織或體液，必須確立在生產工藝中包含能夠有效滅活/去除病毒的特定工藝步驟，以保證產品的病毒安全性。病毒滅活/去除工藝驗證主要應考慮生產工藝中是否含有有效的病毒滅活或去除生產工藝，至少應包含從機制上可以互補的兩種有效工藝步驟，主要方法包括巴斯德消毒法、低pH孵放法、干熱滅活法、有機溶劑處理法和膜過濾法等。

3.4質量研究與控制的技術要點及方法展望 生化藥是按化學藥管理的一類生物藥物，其特點是相對分子質量大、不均一、易受生產工藝影響，可能包含的組分種類較多，如氨基酸、微量元素、短肽、蛋白質、酶、多糖、核酸及降解產物等，目前無法用一種手段來控制其質量，必須用組合技術手段來進行質量標準研究[5]。

常規化學藥注射劑檢驗項目如pH值、澄清度與顏色、干燥失重、水分、細菌內毒素、熱原、無菌、異常毒性、降壓物質、不溶性微粒等同樣適用于生化藥注射劑的質量控制。此外，還有一些應用較多的新型技術手段，包括色譜、質譜、免疫化學、分子生物學、生物測定等技術，需要根據生化藥所含組分的特征，采用合適的分析方法進行質量研究和控制[5]。

3.4.1動物源性原材料的種屬鑒別 種屬鑒別屬于分子生物學技術，通常有常規聚合酶鏈反應(PCR)法、實時熒光PCR法和核酸測序法等。

常規PCR法是采用PCR技術對不同動物基因組中的特征性片段進行擴增，并進一步采用限制性內切酶酶切方法對擴增產物的序列進行確證，從而進行種屬鑒別。實時熒光PCR法是對不同動物基因組中的特征性片段擴增的循環閾值(Ct值)進行測定，從而判定樣品的種屬來源。與常規PCR相比，實時熒光PCR法靈敏度高，操作簡便，檢測通量大，但儀器及試劑成本較高。筆者所在實驗室目前已將常規PCR法和實時熒光PCR法應用到牛脾勻漿、小牛血清、垂體后葉、玻璃酸酶、肝水解肽、肝素鈉等生化藥原材料的種屬鑒別[6-8]。DNA條形碼分子鑒定法(也是核酸測序法)是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術。主要用于中藥飲片鑒別，生化藥原材料鑒別還在驗證。

3.4.2糖蛋白的糖基化分析 目前已上市的蛋白藥物中三分之二以上是糖蛋白，如卵泡刺激素等。蛋白的糖基化與其功能密切相關，有必要對蛋白的糖基化進行分析。歐美藥典收載的糖蛋白，在結構式描述中不僅給出氨基酸序列，而是將糖基化位點和糖鏈結構標出。因此，糖蛋白分析在表征生化藥的結構上具有重要意義。糖蛋白藥物的糖基化分析可分為完整蛋白水平、游離糖鏈水平、糖肽水平和單糖水平，使用的技術主要有色譜技術、質譜技術和毛細管電泳技術等[9]。筆者所在實驗室采用色譜和質譜聯用技術對尿促卵泡素的糖鏈結構進行分析[10]，并完成我國第一個將糖蛋白結構中主要糖基化位點和糖鏈結構訂入藥品質量標準的制訂工作。

3.4.3分子量與分子量分布測定 分子量與分子量分布是蛋白質、多糖類藥物的重要質控指標之一，最常用的檢測方法是分子排阻色譜法，測定的是相對分子質量，采用不同的分子量對照品及色譜柱會對測定結果產生影響。凝膠色譜聯合多角度激光光散射檢測法是近年來興起的生物大分子分子量測定技術，無需分子量對照品的校正，完全不依賴于未知樣品與標樣結構及性質的相似性，可用于絕對分子量與分子量分布的表征，是目前各種測定分子量方法中最接近真值的方法，已陸續應用于羥乙基淀粉、琥珀酰明膠和玻璃酸鈉注射液等多個生化藥注射劑的測定并訂入質量標準[11-12]。

3.4.4多肽的雜質分析 與經典小分子化學藥相比，多肽在有關物質檢查項目存在一定特殊性，由起始物料引入的雜質、工藝相關的雜質和降解產生的雜質等復雜多樣，包含差向肽雜質、消旋肽雜質、鏈端雜質、側鏈雜質、氧化/還原雜質、多聚體雜質等，這些雜質與多肽藥物的療效和不良反應緊密相關，必須加以控制。為實現有效檢出各潛在雜質，通常需要采用多種不同原理的檢測方法如反相高效液相色譜法(RP-HPLC)、離子交換高效液相色譜法、分子排阻高效液相色譜法等，也可采用液相色譜-質聯用技術進行雜質分析[13]。

3.4.5氨基酸測定 氨基酸分析法主要用于肽的氨基酸組成、水解蛋白中氨基酸組成和復方氨基酸制劑中各組分的含量測定等，分析方法主要分為柱后衍生和柱前衍生兩大類。其中常用的氨基酸柱前衍生化方法有異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate，PITC)衍生化、6-氨基喹啉-N-(羥基琥珀酰亞氨基)氨基甲酸酯(6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidel carbamate，AQC)衍生化、鄰苯二醛(O-phthaldialdehyde，OPA)和9-芴甲基氯甲酸甲酯(9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC)衍生化、2，4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB)衍生化等，采用高效液相色譜儀測定；柱后衍生化方法主要有茚三酮衍生化，需用氨基酸分析儀測定[14]。歐美藥典均收載，《中華人民共和國藥典》2015年版還沒有收載，但在生化藥各論品種中應用廣泛。

3.4.6免疫化學測定 免疫化學方法主要有免疫雙擴散法、免疫電泳法、免疫印跡法和酶聯免疫法等，這些方法已廣泛應用于生化藥的鑒別、純度/雜質分析(包括病毒抗原或抗體的檢測)，同時也被用于效價測定、穩定性及其他質量屬性的分析。歐美藥典均收載了“免疫化學測定法”通則，《中華人民共和國藥典》2015年版還未收載，目前正在起草。

3.4.7單核細胞激活測定 生化藥來源復雜多樣，工藝過程易受污染，必須進行熱原檢查。單核細胞激活測定法是熱原家兔法的替代方法，屬于生物測定中的安全性試驗。傳統熱原檢查方法有家兔法和細菌內毒素法，而單核細胞激活測定法是家兔法的替代方法，主要有人全血法、人外周血單核細胞法和單核細胞系法，2008年首次收載于《歐洲藥典》(EP7.0)，《中華人民共和國藥典》《美國藥典》和《日本藥局方》目前均尚未收載該法。筆者所在實驗室開發的單核細胞系法經過驗證，可廣泛用于疫苗、血液制品、單抗制劑和生化藥品[15-16]，在藥品質量控制中具有應用前景。

3.4.8活性測定 除了理化和安全性檢驗項目外，活性測定也是評價生化藥有效性的關鍵質量屬性，是質量控制的重要組成部分。筆者實驗室建立了多個體外活性測定方法，能有效對鹿瓜多肽注射液、注射用核糖核酸Ⅱ等生化藥注射劑進行活性評價[17-18]。生物活性方法的建立必須進行方法學驗證，但由于活性測定中劑量反應曲線遵循的數學模型與一般理化測定方法不同，如用得最多的一種模型是四參數回歸模型，因此驗證方法并不能采用理化測定方法常用的驗證方法。目前《中華人民共和國藥典》2015年版通則中對于生物活性尚沒有給出具體的統計分析方法，不同標準中采用四參數logistic 模型計算供試品生物學活性的算法存在多種形式，通過不同算法獲得的試驗結果可能存在差異[19]，因此生物活性和效價測定的驗證方法需要進一步規范，筆者實驗室正在擬訂下一版《中華人民共和國藥典》的“生物活性和效價測定方法驗證指導原則”。

4 結束語

生化藥注射劑由于來源特殊、成分復雜及其給藥特點，是需要高度關注的風險較高的品種之一，有必要采用多種技術手段相結合的方式進行質量評價，以實現優勝劣汰，建立和健全結合起始原料和工藝過程的產品的整個生命周期的質量控制體系，全面提升我國生化藥注射劑的質量水平。