仿制藥一致性評價中人體生物等效性試驗豁免申請的進展及輔料影響考量點

廖萍，朱嘉，張景辰，吳浩，姜紅

(1.上海藥品審評核查中心，上海 201203；2.湖北省藥品監督檢驗研究院，武漢 430075)

自國家原食品藥品監督管理總局于2016年5月發布《人體生物等效性試驗豁免指導原則》，并于2018年5月及2018年7月分別發布可豁免或簡化人體生物等效性(bioequivalence, BE)試驗品種第一批清單和第二批征求意見稿，以及2018年7月發布征求289種基本藥物目錄中的國內特有品種評價建議以來，有超過67個品種有望通過BE豁免申請簡化評價流程，減少不必要的健康人體藥物暴露，降低評價費用，加快評價進程。筆者對BE豁免申請與批準現狀進行調研，并針對BE豁免申請中的難點之一——基于生物藥劑學分類系統(Biopharmaceutics Classification System，BCS)的豁免申請中輔料的種類與用量的影響進行分析，現報道如下。

1 仿制藥一致性評價中BE豁免申請與批準現狀

據不完全統計，截至2018年9月24日，國家藥品審評中心(Center for Drug Evaluation, CDE)共受理一致性評價申請372份，其中BE豁免申請31份，占比8.3%，涉及12個品種，見圖1。目前僅3家蒙脫石散生產企業申請BE豁免獲得批準。

經對企業的走訪調研，企業BE豁免申請和獲批品種數量不多的主要原因有如下幾點：第一，目前公布的豁免清單品種大多為基本藥物，上市時間長，品種老，利潤空間小，企業不愿意進行再次研發投入，擬放棄品種再評價；第二，BE豁免在國內的研究基礎還比較薄弱，企業對豁免政策不了解，對所需技術要求不能充分把握；第三，BE豁免研究技術要求高、難度大。如企業對于品種是否滿足BE豁免條件的分析能力不足，沒有有針對性地開展輔料種類、用量等對于影響藥物吸收的方式和原理研究，申報資料無法滿足BE豁免的評價要求。筆者針對以上研究過程中的難點問題展開分析和討論。

2 基于BCS分類的BE豁免中輔料種類與用量的要求

在基于BCS分類的BE豁免申請中，在確定了原料藥的BCS分類后，制劑處方組成中的輔料種類與用量是重要考量點，將決定BE豁免申請能否被藥監部門接受。

國際人用藥品注冊技術協調會(International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH)指導原則《M9：基于生物藥劑學分類系統的生物等效性豁免》進入第3階段征求意見，對企業普遍關心的BCS分類標準、BE豁免標準及所需支持證據進一步細化，并在ICH成員國之間達到協調。“若藥物滿足溶解性和滲透性標準(BCSⅠ類和Ⅲ類)，藥品是具有全身作用的普通口服劑型，并且劑型與參比制劑藥學等同，則該藥品適用于基于BCS的生物等效性豁免”[1]。

基于BCS分類的BE豁免要求受試制劑與參比制劑的輔料差異不能影響藥物體內吸收，即吸收速率和吸收程度。在制劑中存在的一些“活性”輔料，能改變藥物生物利用度和(或)生物等效性。特別是可能對BCSⅢ類藥物的生物等效性產生較大影響。這些“活性”輔料對藥物體內吸收的影響包括溶解性、胃腸動力、膜完整性、生理pH值、通過時間及包括轉運機制在內的腸道滲透性。

A.維生素B6片；B.碳酸氫鈉片；C.氯化鉀顆粒；D.蒙脫石散；E.聚乙二醇4000散；F.對乙酰氨基酚片；G.鹽酸普萘洛爾片；H.氟康唑片；I.拉米呋定片；J.鹽酸尼替丁膠囊；K.異煙肼片；L.氨基葡萄糖類口服固體制劑；M.甲鈷胺片；N.左乙拉西坦片

圖1 仿制藥一致性評價中BE豁免申請情況

A.vitamin B6tablets；B.sodium bicarbonate tablets；C.potassium chloride granules；D.montmorillonite powder；E.polyethylene glycol 4000 powder；F.paracetamol tablets；G.propranolol hydrochloride tablets；H.fluconazole tablets；I.lamivudine tablets；J.nitidine hydrochloride capsules；K.isoniazid tablets；L.aminoglucosamine oral solid preparation；M.mecobalamin tablets；N.levetiracetam tablets

Fig.1BEwaiverapplicationinconformityevaluationofgenericdrugs

在ICH M9中對BCSⅠ類和BCSⅢ類藥物的可允許輔料量差異進行了明確規定。對于BCSⅠ類藥物，允許輔料存在種類和用量差異，但對于可能影響吸收的輔料，種類應相同且用量相似(即用量應在參比制劑相應輔料用量的±10.0%范圍內)。BCSⅢ類藥物，所用輔料應種類相同且用量相似，除對于可能影響吸收的輔料應在參比制劑相應輔料用量的±10.0%范圍內以外，還具體規定不同功能輔料用量的變異性，如填充劑為±10.0%，作為崩解劑的淀粉為±6.0%，其他崩解劑為±2.0%，粘合劑為±1.0%，作為潤滑劑的硬脂酸鈣或硬脂酸鎂為±0.5%，其他潤滑劑為±2.0%，作為助流劑的滑石粉為±2.0%，其他助流劑為±0.2%，并規定輔料總變異量不能超過10.0%(不包括薄膜包衣或膠囊外殼)[1]。

3 輔料種類與用量對藥物體內吸收的影響

藥用輔料是生產藥品和調配處方時的賦形劑和附加劑，是藥物制劑的基礎材料和重要組成部分，是可能影響藥品質量、安全性和有效性的重要成分。輔料的物料性質、功能性質、來源、生產工藝、生物藥劑學性質都可能影響制劑性質，見圖2。

通常，藥物主要吸收部位是小腸。正常成人小腸全長5～7 m，遍布絨毛膜，具有巨大的比表面積，面積約200 m2，一般藥物溶液在小腸停留2～4 h。小腸上皮細胞頂膜表達有多種內向轉運體(如寡肽轉運體PepTide等)，這些轉運體參與氨基酸、肽類以及多種營養物質的吸收。此外，人類和嚙齒類動物小腸上皮細胞頂膜還表達能量依賴的外向轉運體，如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)。這些轉運體對藥物吸收有顯著影響。

P-gp蛋白外排藥物的作用機制是：當藥物與底物結合區接觸時，ATP酶接觸到核苷酸結合機構區(nucleotide binding domain，NBD)上，ATP水解提供能量，P-gp結構構型改變，將藥物從高親和的位點轉移至低親和的位點并被排出到細胞外。其外排藥物時具有底物作用廣泛、2種底物可與P-gp競爭性結合、ATP依賴性和外排飽和性等特征。很多非離子型表面活性劑都具有抑制P-gp作用，而離子型表明活性劑(陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和兩性離子表面活性劑)無此作用，這可能與它們所帶的電荷有關[2]。

細胞色素P450(CYP)是人小腸最主要的Ⅰ相代謝酶，是由多種同工酶組成的基因超家族。CYP3A4是CYP最重要亞型之一，參與腸道約90%藥物代謝。以表面活性劑和聚合物為主的藥用輔料能抑制CYP3A4活性，提高AUC，降低CL/F，提高藥物口服生物利用度。P-gp與藥物代謝酶CYP3A4呈現協同作用。

因基于BCS分類的BE豁免申請已要求提供溶出度信息，并對溶出度有快速溶出或非常快速溶出要求，狹義上輔料對藥物體內吸收的影響即為輔料種類與用量對口服固體制劑在體內崩解后小腸吸收性質的影響。影響方式包括影響藥物滲透性、影響藥物溶解性、影響小腸動力從而影響小腸通過時間、影響黏液完整性、影響生理pH值、影響藥物代謝、影響轉運蛋白功能、改變小腸膜表面微觀環境等[3-8]。

以下對常見的可能影響吸收的輔料種類、用量及影響方式進行分析。

3.1糖醇類 糖醇通常用作口服固體制劑中的稀釋劑或甜味劑，包括甘露醇、山梨醇、麥芽糖醇、木糖醇和乳糖醇等。大多數糖醇難以吸收，在腸道中存在滲透作用，可以通過在小腸中的滲透勢來影響低滲透性藥物的吸收，稱為“滲透活性輔料”。與高滲透性化合物相比，此類輔料對低滲透性藥物的吸收和生物利用度的影響更顯著。

有研究表明，當山梨醇用量從1.25 g增加到2.5和5 g時，BCS Ⅲ類藥物雷尼替丁生物利用度降低了7.2%、25%和45.5%。相比之下，在美托洛爾溶液或茶堿片中加入山梨醇沒有發現該不良作用，表明山梨醇滲透作用對BCS I類藥物的生物利用度或生物等效性幾乎無影響，而對BCS Ⅲ類藥物影響明顯。在甘露醇中也觀察到類似影響作用，使用甘露醇2.264 g可導致西咪替丁生物利用度降低約30%[2]。

除了滲透作用外，糖醇類輔料對藥物體內吸收的影響還可能由于水通量變化而導致跨膜拖曳效應，以及改變胃腸道神經免疫激素控制等。糖醇類輔料對化合物的腸吸收影響還依賴于化合物的吸收特征(如吸收機制和吸收位點)。

圖2 可能影響制劑性質的輔料性質魚骨圖

3.2聚乙二醇 表面活性劑聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)相對分子質量范圍廣(200～35 000)，低相對分子質量(<600)PEG本質上是液體，通常用于增加水溶性差藥物的溶解度和生物利用度，還可作為增塑劑、溶劑、軟膏及栓劑的基質、片劑及膠囊劑的潤滑劑等。PEG結構式見圖3，不同級別PEG相對平均分子量見表1。

圖3 PEG分子結構式

Tab.1PEGgradeandaveragemolecularweight

PEG不能在腸內被吸收，而通過滲透作用保留流體。PEG影響藥物吸收的機制較復雜，包括稀釋、溶解度改變、對腸黏膜直接作用、加速腸道轉運時間以及與外排轉運蛋白P-gp具有相互作用從而導致腸滲透性與運動性發生變化等。

研究表明，不同濃度PEG-400對雷尼替丁的小腸吸收具有不同影響作用，且呈現性別差異。對于男性受試者，隨著PEG-400在0.5～1.5 g范圍內增加，峰值達到0.75 g，然后逐漸下降至1.5 g的基線。對于更大劑量的PEG-400，2.5，5，10 g PEG-400分別使雷尼替丁溶液的生物利用度約降低38%，38%和31%。對于女性受試者，0.5～1.5 g的PEG-400降低雷尼替丁生物利用度。雷尼替丁生物利用度的性別差異部分歸因于PEG-400對小腸轉運的滲透作用及其通過抑制P-gp外排轉運和(或)改變膜流動性而調節腸通透性之間的潛在綜合相互作用。小劑量(0.5～1.5 g)下，在男性受試者中，PEG-400對雷尼替丁生物利用度的提高是由于該輔料具有調節腸通透性能力。而在小腸轉運時間顯著加快，遮蔽了較大劑量(≥2.5 g)PEG-400的吸收增強機制。另一方面，女性受試者可能具有較高比例的腸外排出轉運蛋白如乳腺癌抗性蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)，可能造成生物利用度性別差異[2]。

閆方[7]采用外翻腸囊法作為體外模型，研究排除神經和血流情況下PEG-400對環孢素腸道吸收的作用。結果顯示，5 mg·mL-1PEG-400(23.16%)和10 mg·mL-1PEG-400(42.08%)在90 min時能顯著增加環孢素透膜吸收量。整體動物模型實驗也顯示，不同濃度PEG-400能不同程度提高環孢素最大血藥濃度及藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)。

PEG-4000和PEG-400具有相似滲透作用性質并影響腸道中的藥物吸收。阿莫西林為BCS Ⅲ類藥物，其腸道轉運由被動擴散和通過二肽載體介導的主動轉運所進行。有研究表明，小劑量(2.95 g)PEG-4000將阿莫西林AUC降低了8.4%，劑量范圍為2.95～10 g的PEG-4000滲透勢和藥物生物利用度降低之間存在線性關系。

當在Caco-2細胞系中與PEG-400、PEG-2000和PEG-20000孵育時，發現羅丹明123 (P-gp底物)的外排轉運顯著降低。這些PEG對腸P-gp功能的抑制作用在0.1%～20% (V/V或W/V)的范圍內呈濃度依賴性。還發現其他PEG衍生物，例如PEG-32月桂酸甘油酯、PEG-35蓖麻油、PEG-20硬脂酸酯、PEG-50硬脂酸酯、PEG-12硬脂酸酯和PEG-660 12-羥基硬脂酸酯對P-gp功能的抑制作用與輔料濃度的對數相關[2]。

3.3十二烷基硫酸鈉 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl dulfate，SDS)對低滲透性藥物的滲透性顯示濃度依賴作用，SDS在低濃度(0.139 mmol·L-1)時增加藥物表觀滲透性(Papp)，SDS濃度增加時，由于賦形劑介導的對單層細胞膜的破壞作用，藥物滲透性甚至更大。

研究表明，少量SDS(3.64 mg)即影響利培酮片生物利用度。仿制藥阿侖膦酸速釋片中(BCS Ⅲ類藥物)添加SDS而原研藥品中未添加，導致阿侖膦酸生物利用度增加5～6倍，進而導致生物不等效。阿司匹林片(BCSⅢ藥物)，SDS4 mg增加其生物利用度超過5倍。

3.4聚山梨酯類 聚山梨酯類非離子表面活性劑常作為難溶性藥物增溶劑與乳化劑。有研究表明，聚山梨酯80可增加羅丹明123在單層Caco-2細胞模型中頂膜-基底膜(apical side - basolateral side，AP-BL)方向的轉運并減少基底膜-頂膜(BL-AP)方向的轉運。由于聚山梨酯80對P-gp的抑制作用，聚山梨酯80可增加P-gp底物，如西咪替丁、環孢素等藥物的表觀滲透系數。

3.5泊洛沙姆(poloxamer) 泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，分子量1000～7000，由適量的聚氧丙烯與聚氧乙烯共聚成親油水平衡值不同的化合物，為一類新型的高分子非離子型表面活性劑，可用作制劑的乳化劑、穩定劑、增溶劑、吸收促進劑、固體分散劑、緩釋材料。泊洛沙姆促進藥物吸收，一方面由于本品使腸蠕動變慢，藥物在胃腸道中滯留時間增長，吸收增加，從而能提高口服制劑生物利用度，另一方面為增加腸壁通透性，促進藥物吸收。

3.6卡波姆 卡波姆是以非苯溶劑為聚合溶劑的丙烯酸鍵合烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚的高分子聚合物，可以用于口服固體制劑的潤濕劑、粘合劑等。

福辛普利是Pept1轉運體高親和力的底物，孫筱[6]以其為探針底物，發現0.1%和0.2%卡波姆934P對福辛普利空腸的吸收有顯著促進作用(P<0.05)，0.5%卡波姆934P對福辛普利在十二指腸、空腸和回腸三段腸的吸收都有顯著促進作用(P<0.05)。

3.7焦磷酸鈉 焦磷酸鈉(sodium pyrophosphate)可用作泡騰劑輔料，導致藥物產品快速崩解。在雷尼替丁相對生物利用度研究中，發現同時給予1.132 mg (5.1 mmol) 焦磷酸鈉可顯著降低雷尼替丁吸收(AUC減少54%)，這與使用閃爍攝影成像技術得到的小腸轉運時間減少56%的結果平行[2]。

4 結束語

BE豁免可簡化仿制藥一致性評價流程，減少不必要的健康人體藥物暴露，降低評價費用，加快評價進程，但也面臨著研究難度大、技術要求高、具體標準規范還不夠明確的問題，需要企業充分把握政策要求，科學分析BE豁免風險，并與藥監部門保持通暢的溝通交流。