硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑體外一致性評價方法*

肖夢琦，李苗

(1.湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065；2.武漢藥品醫療器械檢驗所，武漢 430075)

近年來,由于空氣污染以及人口老齡化，哮喘及慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發病率逐年升高。吸入制劑作為哮喘及COPD的急救用藥，市場發展前景廣闊，其質量關系到成千上萬患者的生命安全。

硫酸沙丁胺醇是β2受體激動劑，能選擇性作用于支氣管平滑肌[1]并使之松弛，常用于治療支氣管哮喘、COPD[2]、肺氣腫等疾病，常見的劑型有氣霧劑、片劑[3]等。硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑能夠在哮喘急性發作時迅速緩解支氣管痙攣[4]，為常用平喘藥[5]，近年來在肺部疾病中的應用明顯增加[6]，但由于吸入制劑技術含量高，研發難度大，國內生產企業較少。目前硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑在國內的生產企業少，通過氟利昂替代的企業更少，臨床大量使用進口藥品且需求量大。因此開展吸入制劑的體外一致性評價方法研究，對該劑型的質量與療效一致性評價工作尤為重要。

定量吸入氣霧劑由驅動器、定量閥和加壓鋁罐組成。微細粒子空氣動力學特性是定量吸入氣霧劑質量控制的重要內容，利用安德森撞擊器(Anderson Cascade Impactor，ACI)可以對微細粒子空氣動力學特性進行評估，《美國藥典》《英國藥典》《歐洲藥典》均收載了該方法，且相關實驗操作步驟與《中華人民共和國藥典》2015年版的描述大致相同。

ACI由8個收集板及相應的8個篩板(0-7級)、F級篩板、連接0級與人工喉錐部、人工喉和底座組成，從0級至7級篩板的孔徑逐級減小，通過各級收集板收集的藥物顆粒量來分析氣霧劑中微細粒子的粒徑分布情況。筆者在本實驗比較兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑的微細粒子空氣動力學特性，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司，配四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、紫外檢測器和Empower工作站)；Phenomenex Luna C18(2) 100A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)； XS-105電子天平[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；DFM 2000流量計、ACI(S)、HCP5真空泵(英國Copley公司)；科普利吸入制劑測試數據分析軟件(Copley Inhaler Testing Date Analysis Software)；ACI濾膜(英國Copley公司，玻璃纖維濾膜，直徑76 mm，型號：5240) ；SevenEasy pH計[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2試藥 硫酸沙丁胺醇對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100328-200703，含量：99.3%)；甲醇(Fisher Scientific，色譜純)，無水乙醇、丙三醇、磷酸二氫鈉、磷酸(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170728，分析純)；Brij35(聚氧乙烯月桂醚，SIGMA-ALDRICH公司，批號：MKBZ0816V，色譜純)；超純水。硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑(A企業生產，批號：BB0549；規格：200撳，按沙丁胺醇計每撳100 μg，無氟利昂配方)；硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑(B企業生產，批號：1605012，1607041，1608005，1703004，1704001；規格：200撳，按沙丁胺醇計每撳100 μg，無氟利昂配方)。

2 方法與結果

2.1色譜條件與系統適用性 HPLC法，使用Phenomenex Luna C18(2) 100A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(0.08 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液，用磷酸調節pH值至3.10)-甲醇(85：15)；柱溫35 ℃；樣品溫度15 ℃；檢測波長：276 nm；流速1 mL·min-1；進樣量100 μL。理論板數按沙丁胺醇峰計應不低于3000[7]。

2.2對照品溶液的制備 取硫酸沙丁胺醇對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL溶液置20 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.3微細粒子空氣動力學特性測定方法 稱取Brij35 3 g，溶于無水乙醇20 mL，精密量取溶液2 mL，與甘油10 g充分混合均勻，制成甘油-Brij35混合液。用移液器吸取甘油-Brij35混合液70 μL，分別置于ACI裝置中每一級收集板上，并用擦鏡紙均勻涂布。

在ACI的F級放入合適的濾膜并用O型環固定。逐級安裝ACI，L型管(人工喉)的末端與流量計相連，撞擊器下方底座的出口與真空泵相連，應保證系統的氣密性。開啟真空泵，調節氣體流量，使L型管進口處的氣體流速為28.3 L·min-1(±5%)[8]，關閉真空泵，取下流量計，將合適的吸嘴適配器安裝在L型管的末端，再將驅動器插入適配器內。將藥罐插入另一個驅動器，振搖5 s后立即噴射1次，共棄去5撳，取下藥罐，開啟真空泵，將藥罐振搖5 s后插入連在L型管上的驅動器中，立即噴射1次；取下藥罐，振搖5 s，重新插入驅動器中，噴射第2次；重復此過程，共噴射10次。精密量取溶劑各10 mL，分別淋洗驅動器、0-7級各級的篩孔內壁和收集板、濾膜和O型環；精密量取20 mL溶劑潤洗L型管的內壁，分別收集上述11份洗液，HPLC進樣分析。取A企業樣品3支、B企業樣品每個批號各1支，按照上述實驗步驟，每支進行2次實驗。

2.4測定結果 兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑的微細粒子空氣動力學測定結果見表1。

2.5計算結果 利用Copley Inhaler Testing Date Analysis Software對微細粒子空氣動力學測定結果進行計算和分析。由于兩個企業樣本均較少(n≤10)，且樣本總體分布未知，故采用Wilcoxon Mann-WhitneyU秩和檢驗分析兩個企業的樣本，采查表法，利用兩樣本比較的秩和檢驗用T界值表判定兩組總體是否有顯著性差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

2.5.1微細粒子分數(fine particle fraction，FPF) 藥物顆粒直徑>5 μm時被認為沉積于口咽部而無法進入肺部發揮作用[9-10]，故FPF按粒徑不超過5 μm的藥物顆粒占藥物遞送量的比例計算。兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑的FPF計算結果見圖1，表2。

根據表2結果，秩和檢驗統計量T=21，使用查表法，得單側檢驗區間界值為27～75，T不在界值內，則P<0.05，B企業樣品的FPF高于A企業樣品。

2.5.2空氣動力學質量中位直徑(mass median aerodynamic diameter，MMAD)和幾何標準偏差(geometric standard deviation，GSD) 兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑MMAD計算結果見圖2，表3；GSD計算結果見圖3及表4。

表1 微細粒子空氣動力學測定結果

Tab.1Determinationresultsofaerodynamicsoffineparticleμg·(10撳)-1

企業產品批號與瓶號驅動器L管0級1級2級3級4級5級6級7級濾膜A企業(批號:BB0549) 瓶1-1105.40606.0329.8017.0120.4073.56115.4156.988.711.451.04 瓶1-2124.23510.3630.5214.1619.1777.68124.0562.448.231.811.05 瓶2-1102.46529.0012.8611.8317.6668.90102.7543.195.660.970.70 瓶2-2135.71547.8139.7920.6024.3375.9999.1337.066.681.730.74 瓶3-1129.22453.1129.0117.5323.3985.35108.2043.117.031.750.80 瓶3-2133.23524.7433.3517.1721.5777.12103.1740.796.331.701.55B企業(批號:1605012) 1605012-157.44587.5212.289.50113.4773.48167.96107.2312.842.100.88 1605012-248.64599.0612.789.6712.3468.38150.8492.5112.502.170.90 1607041-178.26552.9612.848.1112.9074.17167.0587.9110.211.750.86 1607041-276.31581.2512.379.6911.9166.07151.5478.639.501.980.95 1608005-148.79617.497.086.8710.3469.53183.67109.7911.771.920.61 1608005-251.32642.528.137.5210.6368.45183.5886.6310.332.760.71 1704001-147.36543.4513.0410.0012.6478.57176.6090.0210.522.491.48 1704001-255.96584.237.856.659.6854.81142.5493.2911.362.951.17 1703004-183.50523.2321.0812.9818.3686.48146.6665.378.861.460.59 1703004-2115.60536.2610.848.7814.5975.21141.0568.339.142.691.29

圖1 空氣動力學微細粒子分數測定結果

Fig.1Resultsofaerodynamicsoffineparticlefraction(FPF)

根據表3、表4結果，秩和檢驗統計量分別為T=81與T=79.5，采用查表法，得單側檢驗區間界值為27～75，T不在界值內，則P<0.05，A企業樣品的MMAD與GSD均大于B企業樣品，因此認為兩種氣霧劑微細粒子的粒徑分布情況存在差異。

表2 FPF計算結果

Tab.2FPFresults%

2.5.3各級藥物沉積量(μg)所占比例 從圖4可知，與A企業樣品比較，B企業樣品藥物顆粒在0～2級沉積量較低，在4～6級沉積量較高，且殘留于驅動器的比例較小；二者藥物顆粒在7級和濾膜上的沉積量較接近。

2.6數學模型 藥物顆粒直徑>5 μm時被認為沉積于口咽部而無法進入肺部發揮作用，直徑<1 μm時又被呼出也不能發揮作用。因此以ACI撞擊器2～6級在氣流量為28.3 L·min-1時截止粒徑為橫坐標(X)，以2～6級的藥物沉積量為縱坐標(Y)進行3次回歸，

圖2 空氣動力學質量中位直徑計算結果

圖3 空氣動力學微細粒子幾何標準偏差計算結果

Fig.3GSDresults

建立了空氣動力學微細粒子分布方程為Y=aX3+bX2+cX+K，R2≥0.98，各樣品的擬合曲線見圖5。

由表5和表6可見，A企業樣品微細粒子在各層級藥物沉積量的曲線與分布方程擬合程度較好，各條曲線相關系數均>0.98；B企業樣品各層級藥物沉積量曲線與分布方程擬合程度不夠好，各條曲線的相關系數絕大部分<0.98且彼此差異較大。說明A企業樣品的微細粒子層級分布存在規律，且測定結果差異較小，而B企業樣品微細粒子層級分布規律性不強，結果較雜亂。

表3 空氣動力學質量中位直徑計算結果

Tab.3MMADresultsμm

表4 幾何標準偏差(GSD)計算結果

使用空氣動力學微細粒子分布方程可以表征MDI空氣動力學微細粒子層級分布特征，通過進一步驗證和完善，可能成為評價MDI仿制藥與原研藥空氣動力學特性一致性的有效手段。

3 討論

兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑的微細粒子在粒徑分布上存在差異。B企業樣品的FPF高于A企業樣品，但A企業樣品的的微細粒子層級分布規律性強于B企業樣品，可采用體外撞擊實驗和空氣動力學微細粒子分布方程將樣品繼續與原研藥進行比較研究，對本品空氣動力學特性的一致性進行體外評價，為臨床療效的一致性評價提供參考。

將兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑放入冰箱冷凍過夜后，取出鋁罐，立即在罐的閥門上鉆兩個小孔排氣。待罐內氣體排盡后，割開鋁罐，觀察到明顯不同：①A企業樣品罐內留有白色藥物粉末團塊，未見液體，而B企業樣品罐內留有類白色混懸液，取出后靜置分層，可見兩種樣品的處方明顯不同；②A企業樣品的閥門處明顯殘留藥物粉末，沾滿閥門內壁，而B企業樣品的閥門內僅殘留極少的藥物粉末，可能跟閥門的材料不同有關；③兩種樣品的閥門結構不同，A企業樣品與B企業樣品的閥門長度分別為8.0 mm和8.5 mm，閥門孔徑基本相同，均約為1 mm；④兩種樣品的驅動器噴嘴孔徑不同，A企業樣品的驅動器噴嘴孔徑大于B企業樣品。上述不同之處可能也是導致兩種樣品的微細粒子分布不同的主要原因。

圖4 各級藥物沉積量比例

圖5 空氣動力學微細粒子分布曲線

表5 A企業樣品空氣動力學微細粒子分布方程

Tab.5DistributionequationofaerodynamicsfineparticlefromAcompany

瓶號(批號:BB0549)abckR2瓶1-17.49-83.4257-1290.985瓶1-28.16-90.9279-1400.983瓶2-16.53-73.8231-1220.994瓶2-25.95-68.2219-1170.998瓶3-16.55-75.4242-1290.999瓶3-26.37-72.7222-1230.999平均6.8-77.4242-1270.993RSD/%12.010.79.56.30.7

表6 B企業樣品空氣動力學微細粒子分布方程

Tab.6DistributionequationofaerodynamicsfineparticlefromBcompany

批號與瓶號abckR21605012-112.1-120379-1750.9161605012-210.7-116310-1580.9291607041-111.9-128381-1870.9411607041-210.8-117346-1690.9391608005-113.5-144419-1980.9081608005-213.3-143420-2100.9221704001-112.6-137406-2010.9461704001-210.4-111320-1450.8951703004-19.80-109334-1720.9841703004-29.60-106320-1610.971平均11.5-123364-1780.935RSD/%12.311.411.811.82.9

除微細粒子空氣動力學特性之外，還可以從遞送劑量均一性、每瓶總撳次、每撳重量、水分等方面進行深入研究，以更全面地評價兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑質量的一致性。