萘普生片溶出曲線相似性評價及體內外相關性研究

唐婉，尹菁，張圓，石蓓佳，李攀，3，陸益紅，樊夏雷

(1.徐州醫科大學藥物分析教研室，徐州 221004；2.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 210009；3.中國藥科大學，南京 210009)

仿制藥質量差異直接影響藥物安全性和有效性。2017年2月，國務院正式發布《“十三五”國家藥品安全規劃》，將一致性評價列入產品質量升級工程，其重要性已經上升到國家戰略層面[1]。臨床推廣使用仿制藥的前提，是仿制藥必須與指定的參比制劑藥學等效(pharmaceutical equivalence，PE)和生物等效(bioequivalence，BE)，以避免仿制過程中的質量誤差。仿制藥和原研藥在多種不同pH值溶出介質中溶出行為相似性是評價固體口服制劑PE的重要組成部分，也是對口服固體制劑內在質量評價的最主要方法[2-3]。體外溶出曲線的擬合可幫助仿制藥企業對處方工藝進行篩選與優化[4]。GastroPlusTM軟件[5]是一種基于機制性生理模型的藥動學、藥效學(physiologically based pharmaeokineties/pharmacodynanfics，PBPK/PD)模擬軟件，目前已在美國食品藥品管理局(FDA)、國家藥品監督管理局(National Medical Products Administration)、歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)以及全球頂尖制藥公司中得到廣泛應用，被譽為同類軟件中的“黃金標準”。萘普生 (naproxen)為苯丙酸類非甾體解熱鎮痛藥，臨床主要用于治療風濕性疾病、痛風及術后疼痛等[6]，屬于生物藥劑學分類系統(biopharmaceutics classification system，BCS)II類(低溶解性、高滲透性)藥物。《中華人民共和國藥典》2015年版[7]、《英國藥典》(British Pharmacopoeia，BP2017)[8]、《美國藥典》(United States Pharmacopoeia，USP40)[9]及日本橙皮書[10]均有收載。其中2015年版《中華人民共和國藥典》溶出度項下溶出介質pH值、溶出裝置、取樣時間、檢測波長及限值與日本橙皮書收載方法均有較大差異。筆者對這兩種方法進行比較，以便進一步完善現有檢測標準。采用GastroPlusTM軟件構建萘普生片體內外PK模型，結合體外溶出結果，對各仿制藥進行評價研究，為開展仿制藥質量和療效一致性評價提供可以借鑒的思路。

1 儀器與試藥

1.1儀器 自動溶出儀(采用針式取樣方式，瑞士SOTAX公司)，UV-2550型紫外檢測器(日本島津公司)，真空脫氣機(天大天發科技有限公司)。

1.2試藥 磷酸二氫鉀(批號：20171209)、磷酸氫二鈉(批號：20170306)、冰醋酸(批號：20180118)、氫氧化鈉(批號：20160720)以及鹽酸(批號：20171214)均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；萘普生對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100198-201205，純度：99.9%)。參比制劑萘普生片[日本田邊三菱(Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation)公司，批號：B041A，規格：0.1 g]；仿制制劑分別為A企業樣品(批號：160908)，B企業樣品(批號：170301)，C企業樣品(批號：160501)，D企業樣品(批號：160802)，E企業樣品(批號：150108)，F企業樣品(批號：160703)，G企業樣品(批號：170204)，H企業樣品(批號：009150502)。8家國產制劑規格均為0.1 g。

2 方法與結果

2.1溶出度測定方法的選擇

2.1.12015年版《中華人民共和國藥典》與日本橙皮書收載溶出度方法比較 將參比制劑分別按照日本橙皮書 (漿法，轉速：50 r·min-1，pH值6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質，體積900 mL，檢測波長272 nm)和2015年版《中華人民共和國藥典》(籃法，轉速：100 r·min-1，pH值7.4磷酸鹽緩沖液作為溶出介質，體積900 mL，檢測波長331 nm)中的溶出度檢查方法，測定0，5，10，15，30，45和60 min累積溶出量，以確定更適宜的溶出方法用于本研究，結果見表1。由表1可知，2015年版《中華人民共和國藥典》溶出條件較劇烈，在5 min時累積溶出量已達90.81%。日本橙皮書中收載方法更符合藥物在體內釋放過程[11]。將同一溶出樣品分別于272和331 nm波長處測定吸光度值，計算溶出量，采用SPSS16版統計軟件對結果進行t檢驗分析。結果表明，兩波長下檢測結果差異無統計學意義(P=0.992，>0.05)。272 nm波長處檢測時，需對樣品進行第二步稀釋，該操作可能造成一定誤差，為減少操作誤差、減輕工作負擔，本研究推薦331 nm為檢測波長。

表1 兩種溶出方法累積溶出量測定結果

Tab.1Resultsofcumulativedissolutionwithtwodissolutionmethods

%

2.1.2pH值-溶解度曲線的測定 取過量萘普生原料藥，加入37 ℃溶出介質中振蕩過夜，取適量適宜倍數稀釋，采用HPLC法[7]測定峰面積，按外標法計算振蕩過夜后溶液中萘普生含量，推算萘普生在不同pH值溶出介質中的溶解度(表2)。一般釋放介質的體積為藥物飽和溶液所需介質體積的至少3倍量時認為滿足漏槽條件[2]，表2中以3倍計，根據飽和所需介質體積是否小于釋放介質體積900/3=300 mL來判斷是否滿足漏槽條件。

表2結果顯示，pH值5.5處于漏槽條件的邊緣，隨著pH值增高，萘普生溶解度上升顯著。pH值6.8、pH值7.4溶出介質滿足漏槽條件，萘普生在相同pH值緩沖液中，依磷酸鹽、枸櫞酸鹽、醋酸鹽順序溶解度逐漸增大。

2.1.3溶出曲線測定方法的確定 根據“2.1.1”項溶出度方法比較結果，以及pH值-溶解度曲線測定結果，確定溶出曲線測定方法為漿法，轉速50 r·min-1，體積900 mL，檢測波長331 nm。同時依據pH值-溶解度曲線測定結果，以及萘普生在體內主要吸收部位，選擇以下溶出介質[12]：①pH值6.8磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀1.70 g和磷酸氫二鈉1.775 g，用水溶解并稀釋至1000 mL)；②pH值6.0磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液28 mL，加磷酸二氫鉀6.80 g，水溶解并稀釋至1000 mL)；③pH值5.5醋酸鹽緩沖液(2 mol·L-1醋酸溶液3.0 mL，加醋酸鈉5.98 g，水溶解并稀釋至1000 mL)；④pH值1.2鹽酸溶液(鹽酸7.65 mL，加水稀釋至1000 mL)；⑤水。

表2 萘普生原料藥在不同溶出介質中的溶解度

Tab.2Solubilityofnaproxenindifferentdissolutionmedia

介質溶解度/(mg· mL-1) 飽和所需體積/mL是否符合漏槽條件pH值1.2鹽酸溶液0.02853514否pH值4.0醋酸鹽緩沖液0.04522214否水0.04662146否pH值4.5磷酸鹽緩沖液0.04852062否pH值4.5枸櫞酸緩沖鹽0.06151626否pH值4.5醋酸鹽緩沖液0.1040962否pH值5.0枸櫞酸緩沖鹽0.1270787否pH值5.5磷酸鹽緩沖液0.2890346否pH值5.5枸櫞酸緩沖鹽0.3150318否pH值5.5醋酸鹽緩沖液0.4000250是pH值6.8磷酸鹽緩沖液2.720037是pH值7.4磷酸鹽緩沖液5.120020是

2.2溶出度測定方法的驗證

2.2.1穩定性考察 取萘普生原料藥，置溶出杯中，在上述溶出度測定條件下，分別加入上述5種溶出介質(37 ℃)，于30，45，60，90，120，240 min取樣測定331 nm波長處吸光度，結果表明萘普生在240 min內穩定。

2.2.2線性關系考察 取萘普生原料藥105.66 mg，精密稱定，置100 mL量瓶，用pH值6.8溶出介質溶解并定容，精密吸取適量，用溶出介質稀釋，得21.13，42.26，63.40，84.53，105.66，126.79，149.50 μg·mL-1系列溶液，測定波長331 nm處各濃度溶液的吸光度值，分別為0.1468，0.2904，0.4352，0.5821，0.7165，0.8625，1.0218。線性方程為：Y=0.0068X+0.0037，r2=0.9999。

2.2.3回收率實驗 取相當于萘普生片1片的輔料，按比例精密稱定，置100 mL量瓶，分別加入適量萘普生對照品，用pH值6.8溶出介質溶解并定容，精密吸取適量，用溶出介質稀釋，制成相當于濃度水平為80%，100%，120%的溶液，測定波長331 nm處吸光度，計算回收率。回收率(%)=測得量/稱樣量×100%。結果見表3，平均回收率99.46%，RSD=0.41%。

2.3溶出曲線的繪制 對8種仿制制劑和參比制劑各取1批，按“2.1.3”項確定的溶出介質和方法進行溶出曲線的繪制。pH值5.5、pH值6.0、pH值6.8介質在5，10，15，30，45，60 min時取樣，pH值1.2介質與水中取樣點分別延長至120和240 min，每個時間點取樣10 mL，及時補液10 mL，計算不同時間點累積溶出量，結果見圖1。

表3 pH值6.8溶出介質中萘普生片回收率測定結果

Tab.3ResultsofrecoverytestsonnaproxentabletsindissolutionmediaatpH6.8

n=9

結果表明，參比制劑和仿制制劑在pH值1.2溶出介質和水中盡管均溶出不完全，但溶出速率、累積溶出量仍存在較大差異。參比制劑在pH值5.5、pH值6.0、pH值6.8溶出介質中，10 min時平均溶出率均>85%；8種仿制制劑在pH值5.5、pH值6.0溶出介質中，10 min時平均累積溶出量均<85%；在pH值6.8溶出介質中，僅C廠家制劑在10 min時平均累積溶出量>85%。綜合以上結果，8種仿制萘普生片在5種溶出介質中與參比制劑的累積溶出量均存在較大差異。

2.4溶出曲線相似性評價 采用FDA推薦的相似因子(f2)法，分別對pH值6.8、pH值6.0、pH值5.5溶出介質中仿制制劑與參比制劑的溶出曲線進行相似性評價。f2計算公式如下[13]：f2=50*lg { [1+1/n*∑(Rt-Tt)2]-1/2*100}

其中，n為溶出度試驗取樣點個數；Rt與Tt分別為參比制劑與仿制制劑t時間平均累積溶出量(%)。當兩條曲線f2值>50時，可認為溶出曲線相似，且值越大相似度越高。結果見表4。

結果顯示，在pH值5.5、pH值6.0溶出介質中8種仿制萘普生片與參比制劑溶出曲線相似因子f2值均<50；在pH值6.8溶出介質中僅有C廠家生產的萘普生片f2值>50。即國內8種萘普生片體外溶出曲線與參比制劑基本不一致。

A.pH值6.8緩沖液；B.pH值6.0緩沖液；C.pH值5.5緩沖液；D.pH值1.2溶液；E.水

表4 不同溶出介質中萘普生片溶出曲線相似性分析結果(f2值)

Tab.4Similarityanalysisofdissolutionofnaproxentabletsindifferentmedia(f2)

廠家pH值6.8pH值6.0pH值5.5A25.616.816.3B30.618.614.3C58.743.139.2D23.215.113.9E31.619.417.7F39.324.121.9G26.013.411.7H33.621.225.4

2.5GastroPlusTM軟件建立萘普生片體內外相關性模擬的研究 收集文獻報道的不同給藥途徑、給藥劑量的藥動學曲線，以及GastroPlusTM軟件基于萘普生化學結構預測的理化參數。主要參數有：logP[14]為3.18，pKa[14]為4.15，溶解度(pH值3.96)為0.0649 mg·mL-1，擴散系數為0.87×105cm2·s-1，粒子密度為1.2 g·mL-1，滲透性為1.461×104cm·s-1，半衰期為12.8 h，血漿清除率為1.249 16 L·h-1，表觀分布容積為0.048 94 L·kg-1。

2.5.1萘普生驗證性PK模型的構建 在軟件吸收和處置模型中加載相應理化參數和靜脈注射藥-時曲線數據[15]，模擬藥物體內消除過程，對比預測值與文獻收載實測值差異，評估模型預測準確性，通常模型預測的Cmax和AUC值與實際值誤差≤2倍、擬合度>0.7即可證明建立的模型較準確[16]，擬合度 (R2)越高，模型預測越準確。結果見圖2。

圖2顯示，預測曲線與實測數據點基本重合，PK模型R2達0.976；表明初步建立的PK模型能夠較好地反映萘普生給藥后在人體內的清除和分布特征。

圖2 靜脈給藥PK曲線模擬(曲線)與實測結果(方格)

Fig.2SimulativePKmodel(line)andclinicaldata(squares)ofintravenousadministration

2.5.2口服萘普生500 mg的PK模型驗證 由于口服藥物在人體胃腸道存在溶出和吸收過程，且處置過程較靜脈給藥復雜，故用文獻收載的萘普生片實測數據[17]對GastroPlus軟件預測理化參數和藥動學參數進行驗證，評估GastroPlus軟件模型對口服萘普生給藥后預測的準確性(圖3)。模型預測參數與實測參數基本吻合，R2達0.980，表明模型溶解、溶出過程的公式以及所應用的相關參數較合理地描述了萘普生相應特征，建立的PK模型可行。

圖3 口服萘普生片500 mg PK曲線模擬(曲線)與實測結果(方格)

Fig.3SimulativePKmodel(line)andclinicaldata(squares)oforaladministrationofnaproxenat500mg

2.5.2以pH值6.8為溶出條件預測體內PK曲線 在已驗證的模型基礎上，將參比制劑及8家萘普生片仿制制劑在pH值6.8溶出介質下的體外溶出數據加載到GastroPlusTM軟件，將Dissolution Model設置為Z-factor，軟件通過體外溶出曲線計算萘普生Z-factor值，并將溶出曲線轉換成體內PK曲線，同實測的體內藥時曲線進行對比，結果見圖4。

結果表明，除參比制劑外，8家萘普生片仿制制劑的PK模擬曲線同實測數據均存在較大差異，說明8種萘普生片仿制制劑與參比制劑體內過程基本不一致。

2.5.3模擬PK參數比較 結合溶出曲線等信息，利用所建立的PK模型，對不同企業樣品以及參比制劑的體內藥動學參數進行預測，計算與文獻實測曲線的擬合度。

結果表明，除參比制劑所得參數同文獻參數基本一致，R2為0.979。8家仿制制劑Cmax、tmax同文獻記載參數均存在較大差異，R2均低于0.7。故8家仿制萘普生片與參比制劑PE和BE基本不一致。

3 討論

萘普生片的原研制劑為FDA認可的0.5 g規格的“Naprosyn”(ATHNAHS PHARMA US LTD)，但目前已停產。日本橙皮書公布的萘普生參比制劑為MITSUBISHI Tanabe Pharmaceutical Co.Ltd.(田邊三菱公司)“NAIXIN”0.1 g 規格，且與國內多數仿制制劑規格相同，故本研究采用其為參比制劑。目前，已發表的文獻中，考察萘普生在多種溶出介質中的溶出行為的研究筆者較少見到，且尚未見探究萘普生片體內外相關性的報道，故本研究可為我國仿制藥質量的提升及質量和療效一致性評價提供可以借鑒的思路。

本研究中，由于參比制劑與8家仿制制劑在pH值1.2和水兩種溶出介質中溶出率較低，因此僅對pH值6.8、pH值6.0、pH值5.5三種溶出介質中萘普生片的溶出度數據進行f2計算。由體外溶出曲線可看出，與參比制劑相比，8種仿制制劑溶出速率均較慢，溶出過程中崩散也較慢，故推測其不一致可能由輔料差異和壓片工藝造成。

因無法獲得參比制劑的體內實測數值，故將參比制劑和8家仿制制劑體外溶出數據在已驗證模型基礎上預測的體內參數同文獻實測參數[16]進行比較。結果發現參比制劑所得參數同文獻報道參數基本一致，而8家仿制制劑所得參數與文獻報道的存在一定差異，主要表現為Cmax較低，而Tmax較大，考慮是由于輔料的差異導致藥物延遲時間存在差異，故影響體內藥物的吸收速度和程度。

剖析各家制劑處方工藝，由于萘普生為難溶性藥物，參比制劑選用了聚維酮改進活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient，API)的溶出度，而仿制制劑處方中大多未見增溶輔料。結合一致性評價結果，仿制制劑處方工藝有必要進一步優化，以達到質量和療效與參比制劑一致。

通過GastroPlusTM軟件建立萘普生片的吸收和處置模型，建立仿制藥和原研藥體外溶出曲線與體內藥動學曲線之間的相關性模型是一致性評價工作一種有益的嘗試。若藥物的體外溶出與體內吸收之間能建立良好的相關性，則可通過體外溶出數據預測藥物的體內吸收過程，從而減少BE試驗帶來的經濟負擔，并且縮短藥物的研發周期，降低制劑生物不等效風險。

A.A企業樣品；B.B企業樣品；C.C企業樣品；D.D企業樣品；E.E企業樣品；F.F企業樣品；G.G企業樣品；H.H企業樣品；I.參比制劑

圖4 參比制劑與8種國產萘普生片PK曲線模擬(曲線)與實測結果

A.sample A；B.sample B；C.sample C；D.sample D；E.sample E；F.sample F；G.sample G；H.sample H；I.reference

Fig.4SimulativePKmodel(line)andclinicaldete(squares)ofreferencelisteddruganddomesticnaproxentabletsfromeightcompanies

表5 參比制劑與8種仿制制劑體內PK參數模擬及擬合度比較

Tab.5ComparisonofinvivoparametersimulationandR-squaredamonggenericdrugsfromeightpharmaceuticalcompaniesandreferencelisteddrug

樣品Cmax/(ng· mL-1)tmax/hAUC0-infAUC0-t(μg·h· mL-1)預測與實測曲線擬合度 (R2)文獻[16]115.002.6201960.61834.2參比制劑114.002.4931974.41931.40.979A63.128.6371716.11668.50.371B61.219.2951692.21644.60.363C100.303.5901923.21878.10.617D56.4610.8301621.31573.60.346E65.777.6801744.51697.10.383

續表5 參比制劑與8家仿制制劑體內PK參數模擬及擬合度比較

Tab.5ComparisonofinvivoparametersimulationandR-squaredamonggenericdrugsfromeightpharmaceuticalcompaniesandreferencelisteddrug

樣品Cmax/(ng· mL-1)tmax/hAUC0-infAUC0-t(μg·h· mL-1)預測與實測曲線擬合度 (R2)F83.714.7081856.81810.50.473G66.707.3801753.21705.80.387H71.136.1441787.71740.60.407