許超 張春秋 蔣邦棟 俞蕾 盛成蘭
【摘 要】目的:肺炎克雷伯桿菌(KP)對氟喹諾酮類藥物(FQNs)的耐藥機制,以更好的指導臨床藥物治療。方法:選擇2018.6~2019.5期間臨床分離對環丙沙星耐藥的10株KP,為明確菌株對5種FQNs的MIC值,應用微量肉湯稀釋法檢測;用PCR法檢測菌株染色體和質粒帶有的FQNs基因(gyrA、parC與qnr基因)并測量序列,在試驗法的支撐下檢驗qnr是否出現轉移情況。結果:10株KP對5種FQNs均產生了耐藥性,檢測擴增產物序列后發現10株KP染色體的gyrA、parC基因均有突變,有2株菌株帶有gyrA,以上2菌株的接合菌對FQNs的MIC值上升了5~30倍;未檢測出qnrB陽性的菌株。結論:gyrA、parC基因突變是誘導KP對FQNs產生耐藥性的住院原因,質粒上有gyrA基因吸附,也是形成耐藥性的主要因素之一。
【關鍵詞】肺炎克雷伯桿菌;氟喹諾酮類;藥物耐藥性;機制分析
【中圖分類號】R978.1【文獻標識碼】A【文章編號】1672-3783(2019)12-03--01
FQNs是一類以萘啶酸為基礎、人工合成的抗生素,在細菌感染類疾病臨床治療中有廣泛應用。其作用機制是通過有目的性抑制細菌DNA回旋酶與拓撲異構酶Ⅳ的形式,對細菌DNA復制、轉錄與修復重組過程形成有效抑制,最后中斷細菌的傳代過程[1]。伴隨本藥品的廣泛使用,隨即出現的便是耐藥性問題。KP是一種較為常見的條件致病菌,其發病率僅位居大綱桿菌與銅綠假單胞菌。本文主要對KP的耐FQNs進行分析與研究。
1 材料與方法
1.1 材料 選擇在2018.6~2019.5期間經臨床分離的10株對環丙沙星耐藥(MIC≥32μg/ml)的菌株,所有菌株均采用API系統與ATB系統鑒定到種、實驗質控菌株是KP ATCC700603,結合試驗受體菌是大腸埃希菌j53RifR。
1.2 試劑類型 利福平、環丙沙星(CIP)、諾氟沙星(NFX) 、氧氟沙星(OFX);藥敏紙片及瓊脂或肉湯培養基;Taq DNA聚合酶與dNTPs、離心機與PCR擴增儀、成像分析系統。
1.3 方法
1.2.1 抗生素藥物的敏感試驗 應用微量肉湯稀釋法檢測CIP、NFX、OFX對KP抑菌的最低濃度(MIC),質控菌株是ATCC700603,依照CLSI M100-S19(2009年)判斷藥敏檢測情況[2]。
1.2.2 聚合酶鏈反應(PCR) 利用沸點法提取基因組DNA,明確PCR擴增引物類型及對應的長度、溫度等,結合相關文獻或引物設計引物推薦值設定反應條件。將PCR陽性產物送往Invitrogen公司檢測序列。
1.3.3 質粒結合試驗 篩選出qnr基因呈陽性的菌株進行質粒結合試驗分析。操作流程可以作出如下表述:把處于相同生長期的等量供體菌與受體菌整合至新鮮的LB肉湯內充分混合,在37℃環境中持續培養5h(培養過程中禁止出現震蕩行為)后,將其接種在含有利福平(300μg/mL)與CIP(0.06mg/L)的瓊脂(TSA)平板上有目的性的進行培養,當觀察到出現菌落生長的情況,則提示結合成功。挑選出的接合子經由PCR檢測qnr基因陽性以后,使用API20E系統再次鑒定是否是大腸埃希菌;為進一步明確FQNs基因是否出現轉移情況,則需應用微量肉湯稀釋法分別檢測供體菌、受體菌、接合菌對CIP的MIC值。
2 結果
2.1 10株KP對5種FQNs的檢測情況 具體檢測情況見表1,發現10株KP對5種FQNs均形成了耐藥性。
2.2 耐藥質粒轉移及藥敏試驗分次 K80與K108這兩種菌株經過接合試驗以后,發現其在選擇平板上均有菌落生長繁殖,系統鑒定結果表明都是大腸埃希菌,且PCR鑒定表明含有gyrA基因。藥敏分析結果表明,其對FQNs形成的耐藥性可以以質粒接合為媒介轉移至受體菌E.coli RifrR,促使其對FQNs的MIC至提升5~30倍。
3 討論
既往有學者針對細菌對FQNs的耐藥機制作出深刻的分析,可能的耐藥機制[3]:染色體誘導的耐藥,以藥物作用部位的改變、外膜通透性降低以及自主外排作用等為主,FQNs作用的靶點是細菌的DNA回旋酶與拓樸異構酶Ⅳ,其中前者是由2個gyrA基因編碼的GyrA 亞基與2個gyrB基因編碼的GyrB亞基構成的四聚體,后者是由2個parC、parE基因編碼的2個ParC、ParE亞基構成的四聚體,若有亞基變異均可導致細菌對FQNs形成耐藥性。
本次研究的10株FQNs KP中,GyrA 亞基均出現了第83位氨基酸改變的情況,即83為絲氨酸(Ser)轉變為異亮氨酸(Ⅱe)或者是亮氨酸(Leu)或苯丙氨酸(Phe),促使該位點的親水性下降,FQNs與DNA回旋酶的親和力下降,對藥物耐藥是其典型的外在表現形式。這提示GyrA 亞基第42位氨基酸的改變為KP對FQNs形成耐藥性的主要原因。另外,還有9株菌株還出現了87位氨基酸的改變,具體是有天冬氨酸(Asp)轉化為丙氨酸(Ala)與谷氨酸(Glu),這和國內部分報道相一致[4]。
質粒誘導的細菌對FQNs的耐藥機制是當下國內外臨床上研究的一個重點課題,其對FQNs形成的耐藥性主要是由qnr基因介導的,其中qnrA基因在以上過程中占據主導地位[5、6]。在本次研究中,有2株菌株帶有gyrA,以上2菌株的接合菌對FQNs的MIC值上升了5~30倍(MIC≥255μg/mL);未檢測出qnrB陽性的菌株。gyrA基因質粒轉移至受體菌E.COLIj53.RifR,這可能使其對FQNs產生的耐藥性明顯上升的主要原因,但是沒有抵達耐藥判斷的折點。
總之,gyrA、parC基因突變是誘導KP對FQNs產生耐藥性的住院原因,質粒上有gyrA基因吸附,也是形成耐藥性的主要因素之一。
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