肺炎克雷伯桿菌對氟喹諾酮類抗生素耐藥機制探究

許超　張春秋　蔣邦棟　俞蕾　盛成蘭

【摘 要】目的：肺炎克雷伯桿菌（KP）對氟喹諾酮類藥物（FQNs）的耐藥機制，以更好的指導(dǎo)臨床藥物治療。方法：選擇2018.6～2019.5期間臨床分離對環(huán)丙沙星耐藥的10株KP，為明確菌株對5種FQNs的MIC值，應(yīng)用微量肉湯稀釋法檢測;用PCR法檢測菌株染色體和質(zhì)粒帶有的FQNs基因（gyrA、parC與qnr基因）并測量序列，在試驗法的支撐下檢驗qnr是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果：10株KP對5種FQNs均產(chǎn)生了耐藥性，檢測擴增產(chǎn)物序列后發(fā)現(xiàn)10株KP染色體的gyrA、parC基因均有突變，有2株菌株帶有g(shù)yrA，以上2菌株的接合菌對FQNs的MIC值上升了5～30倍;未檢測出qnrB陽性的菌株。結(jié)論：gyrA、parC基因突變是誘導(dǎo)KP對FQNs產(chǎn)生耐藥性的住院原因，質(zhì)粒上有g(shù)yrA基因吸附，也是形成耐藥性的主要因素之一。

【關(guān)鍵詞】肺炎克雷伯桿菌;氟喹諾酮類;藥物耐藥性;機制分析

【中圖分類號】R978.1【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1672-3783（2019）12-03--01

FQNs是一類以萘啶酸為基礎(chǔ)、人工合成的抗生素，在細(xì)菌感染類疾病臨床治療中有廣泛應(yīng)用。其作用機制是通過有目的性抑制細(xì)菌DNA回旋酶與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的形式，對細(xì)菌DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與修復(fù)重組過程形成有效抑制，最后中斷細(xì)菌的傳代過程[1]。伴隨本藥品的廣泛使用，隨即出現(xiàn)的便是耐藥性問題。KP是一種較為常見的條件致病菌，其發(fā)病率僅位居大綱桿菌與銅綠假單胞菌。本文主要對KP的耐FQNs進(jìn)行分析與研究。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇在2018.6～2019.5期間經(jīng)臨床分離的10株對環(huán)丙沙星耐藥（MIC≥32μg/ml）的菌株，所有菌株均采用API系統(tǒng)與ATB系統(tǒng)鑒定到種、實驗質(zhì)控菌株是KP ATCC700603，結(jié)合試驗受體菌是大腸埃希菌j53RifR。

1.2 試劑類型 利福平、環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NFX） 、氧氟沙星（OFX）;藥敏紙片及瓊脂或肉湯培養(yǎng)基;Taq DNA聚合酶與dNTPs、離心機與PCR擴增儀、成像分析系統(tǒng)。

1.3 方法

1.2.1 抗生素藥物的敏感試驗 應(yīng)用微量肉湯稀釋法檢測CIP、NFX、OFX對KP抑菌的最低濃度（MIC），質(zhì)控菌株是ATCC700603，依照CLSI M100-S19（2009年）判斷藥敏檢測情況[2]。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 利用沸點法提取基因組DNA，明確PCR擴增引物類型及對應(yīng)的長度、溫度等，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)或引物設(shè)計引物推薦值設(shè)定反應(yīng)條件。將PCR陽性產(chǎn)物送往Invitrogen公司檢測序列。

1.3.3 質(zhì)粒結(jié)合試驗 篩選出qnr基因呈陽性的菌株進(jìn)行質(zhì)粒結(jié)合試驗分析。操作流程可以作出如下表述：把處于相同生長期的等量供體菌與受體菌整合至新鮮的LB肉湯內(nèi)充分混合，在37℃環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)5h（培養(yǎng)過程中禁止出現(xiàn)震蕩行為）后，將其接種在含有利福平（300μg/mL）與CIP（0.06mg/L）的瓊脂（TSA）平板上有目的性的進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)觀察到出現(xiàn)菌落生長的情況，則提示結(jié)合成功。挑選出的接合子經(jīng)由PCR檢測qnr基因陽性以后，使用API20E系統(tǒng)再次鑒定是否是大腸埃希菌;為進(jìn)一步明確FQNs基因是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移情況，則需應(yīng)用微量肉湯稀釋法分別檢測供體菌、受體菌、接合菌對CIP的MIC值。

2 結(jié)果

2.1 10株KP對5種FQNs的檢測情況 具體檢測情況見表1，發(fā)現(xiàn)10株KP對5種FQNs均形成了耐藥性。

2.2 耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移及藥敏試驗分次 K80與K108這兩種菌株經(jīng)過接合試驗以后，發(fā)現(xiàn)其在選擇平板上均有菌落生長繁殖，系統(tǒng)鑒定結(jié)果表明都是大腸埃希菌，且PCR鑒定表明含有g(shù)yrA基因。藥敏分析結(jié)果表明，其對FQNs形成的耐藥性可以以質(zhì)粒接合為媒介轉(zhuǎn)移至受體菌E.coli RifrR，促使其對FQNs的MIC至提升5～30倍。

3 討論

既往有學(xué)者針對細(xì)菌對FQNs的耐藥機制作出深刻的分析，可能的耐藥機制[3]：染色體誘導(dǎo)的耐藥，以藥物作用部位的改變、外膜通透性降低以及自主外排作用等為主，F(xiàn)QNs作用的靶點是細(xì)菌的DNA回旋酶與拓樸異構(gòu)酶Ⅳ，其中前者是由2個gyrA基因編碼的GyrA 亞基與2個gyrB基因編碼的GyrB亞基構(gòu)成的四聚體，后者是由2個parC、parE基因編碼的2個ParC、ParE亞基構(gòu)成的四聚體，若有亞基變異均可導(dǎo)致細(xì)菌對FQNs形成耐藥性。

本次研究的10株FQNs KP中，GyrA 亞基均出現(xiàn)了第83位氨基酸改變的情況，即83為絲氨酸（Ser）轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼幔á騟）或者是亮氨酸（Leu）或苯丙氨酸（Phe），促使該位點的親水性下降，F(xiàn)QNs與DNA回旋酶的親和力下降，對藥物耐藥是其典型的外在表現(xiàn)形式。這提示GyrA 亞基第42位氨基酸的改變?yōu)镵P對FQNs形成耐藥性的主要原因。另外，還有9株菌株還出現(xiàn)了87位氨基酸的改變，具體是有天冬氨酸（Asp）轉(zhuǎn)化為丙氨酸（Ala）與谷氨酸（Glu），這和國內(nèi)部分報道相一致[4]。

質(zhì)粒誘導(dǎo)的細(xì)菌對FQNs的耐藥機制是當(dāng)下國內(nèi)外臨床上研究的一個重點課題，其對FQNs形成的耐藥性主要是由qnr基因介導(dǎo)的，其中qnrA基因在以上過程中占據(jù)主導(dǎo)地位[5、6]。在本次研究中，有2株菌株帶有g(shù)yrA，以上2菌株的接合菌對FQNs的MIC值上升了5～30倍（MIC≥255μg/mL）;未檢測出qnrB陽性的菌株。gyrA基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至受體菌E.COLIj53.RifR，這可能使其對FQNs產(chǎn)生的耐藥性明顯上升的主要原因，但是沒有抵達(dá)耐藥判斷的折點。

總之，gyrA、parC基因突變是誘導(dǎo)KP對FQNs產(chǎn)生耐藥性的住院原因，質(zhì)粒上有g(shù)yrA基因吸附，也是形成耐藥性的主要因素之一。

參考文獻(xiàn)：

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