不同絕經(jīng)時(shí)期婦女雌激素受體亞型在陰道組織中的表達(dá)*

蘇 婷 ，宋殿榮，郭 潔 ，張 崴 ，陳然然

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

隨著人類平均壽命的延長(zhǎng)，絕經(jīng)人口比例日益增加，絕經(jīng)問(wèn)題日趨凸顯，絕經(jīng)綜合征是絕經(jīng)相關(guān)的最常見疾病，涉及人體多個(gè)系統(tǒng)、多個(gè)器官，其癥狀表現(xiàn)多樣[1]。雌激素缺乏在許多癥狀的病因?qū)W中起主要作用，從而導(dǎo)致了許多慢性和老化性的疾病如骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病和泌尿生殖道萎縮。在陰道組織中雌激素缺乏導(dǎo)致陰道黏膜萎縮，陰道上皮變薄，皺褶消失，陰道潤(rùn)滑作用下降[2-3]。雌激素通過(guò)雌激素受體（ER）發(fā)揮生物學(xué)作用，以前的研究已經(jīng)證明在陰道壁中存在ER，但對(duì)ER在陰道組織中的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外存在爭(zhēng)議。

在組織中ER的表達(dá)水平不同，組織對(duì)雌激素的反應(yīng)可能不同，了解受體亞型的表達(dá)水平可以更好地理解雌激素對(duì)泌尿生殖道的作用，并可針對(duì)特定的亞型治療泌尿生殖道疾病。因此，本研究擬探討不同絕經(jīng)時(shí)期婦女ER亞型在陰道組織中的表達(dá)，為絕經(jīng)泌尿生殖道疾病的治療提供基礎(chǔ)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年11月—2017年11月天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科因良性疾病行陰式或腹式全子宮切除術(shù)的61例患者納入本研究，分為育齡期（月經(jīng)周期規(guī)律）24例、圍絕經(jīng)期（月經(jīng)周期長(zhǎng)度可變性持續(xù)增加，近10個(gè)月經(jīng)周期中反復(fù)出現(xiàn)相鄰周期提前或延后≥7 d，或月經(jīng)周期間隔>60 d）18例，絕經(jīng)后期（末次月經(jīng)后停經(jīng)≥12個(gè)月）19例，所有研究對(duì)象術(shù)前半年內(nèi)未服用過(guò)類固醇激素類藥物。本研究經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者及家屬知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 每例樣本取足夠的陰道壁組織，沿前穹窿環(huán)向取陰道前壁全層組織2份，大小均為0.8×0.8×0.8 cm3；一份用 4%多聚甲醛固定 24~48 h，常規(guī)石蠟包埋待檢，另一份立即放入RNAlater后轉(zhuǎn)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室置-80℃冰箱凍存用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）分析標(biāo)本。

1.2.2 qPCR檢測(cè)陰道組織中ERα、ERβmRNA表達(dá) 用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度及純度，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，High-capacity cDNAreverse transcription kits（invitrogen）將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為模板 cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR儀（美國(guó)BIO-RAD）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（SYBR Green MIX購(gòu)自DBI公司）目的基因，實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及其產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

表1 qPCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.1 qPCR primer sequences and product length

1.2.3 免疫組化法（IHC）檢測(cè)陰道組織中ERα、ERβ蛋白表達(dá) 將1.2.1中獲得的陰道壁組織石蠟包埋后切片，厚度約3~5μm，將組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃烘烤過(guò)夜；二甲苯脫蠟，1%甲醇雙氧水滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，將切片浸泡在0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中，放入微波爐內(nèi)高火熱修復(fù)抗原10 min；0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次×5 min，切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置20 min，滴加第一抗體（所有抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司），4℃過(guò)夜，PBS洗 3次×5 min，滴加第二抗體，37℃，20 min，PBS洗3次×5 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，將IHC染色切片置于顯微鏡100、400倍下觀察，陽(yáng)性染色為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。隨機(jī)選取每張切片中的5個(gè)視野，每個(gè)視野中各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性率。參考Soslow等[4]文獻(xiàn)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1）陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)的值：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0為0分，1%~10%為1分，11%~50%為2分，51%~80%為3分，81%~100%為4分。2）陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)0為陰性，1為弱陽(yáng)性，2為陽(yáng)性，3為強(qiáng)陽(yáng)性。IHS=陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用SNK法。以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qPCR檢測(cè)陰道組織中ERα、ERβmRNA表達(dá) qPCR結(jié)果分析，與育齡期組相比，圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERαmRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERαmRNA表達(dá)低于圍絕經(jīng)期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與育齡期組相比，圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβmRNA表達(dá)高于育齡期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβmRNA表達(dá)高于圍絕經(jīng)期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 ERα、ERβmRNA相對(duì)定量qPCR結(jié)果（x±s）Tab.2 Relative quantitative qPCR results of ERαand ERβ mRNA（x±s）

2.2 檢測(cè)陰道組織中ERα、ERβ蛋白表達(dá) IHC結(jié)果分析，ERα和ERβ兩種受體均表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，見圖1。與育齡期組相比，圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERα蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERα蛋白表達(dá)低于圍絕經(jīng)期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與育齡期組相比，圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβ蛋白表達(dá)高于育齡期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβ蛋白表達(dá)高于圍絕經(jīng)期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

雌激素是女性重要的生殖激素，雌激素生物學(xué)作用的發(fā)揮需要特異性、高親和力的ER介導(dǎo)[5-7]，在人類細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種經(jīng)典的ER亞型，即ERα和ERβ。研究表明[8-9]，ERα和ERβ具有幾乎相同的DNA結(jié)合域，但其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出很大的差異，并且兩者在參與靶基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的N-末端區(qū)域也有很大差異，導(dǎo)致兩種受體與化合物的親和力不同，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性不同，不同組織中兩種受體亞型的表達(dá)水平不同，因此不同的ER配體組織選擇性作用不同。

關(guān)于不同絕經(jīng)時(shí)期陰道組織中ERα、ERβ的分布及含量變化，兩種受體亞型介導(dǎo)雌激素生物效應(yīng)的作用差異研究結(jié)果不一致。如Chen等[10]發(fā)現(xiàn)ERα和ERβ均存在于絕經(jīng)前婦女的陰道壁組織中，但絕經(jīng)后婦女陰道壁中ERβ的表達(dá)缺失。Perez等[11]發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后陰道組織中ER與血清中雌激素呈負(fù)相關(guān)，但ER與絕經(jīng)的時(shí)間表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，隨著絕經(jīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ER在逐漸增加。Skala等[12]研究ERα、ERβ在陰道壁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ERα在絕經(jīng)后明顯升高，ERβ在絕經(jīng)后明顯降低。Fu等[13]研究表明，絕經(jīng)后婦女陰道壁組織中ERα的表達(dá)水平顯著下降，激素替代療法治療后能明顯升高ERα的表達(dá)，無(wú)論有無(wú)激素替代治療ERβ的表達(dá)水平在絕經(jīng)前后未見明顯變化。

圖1 ERα、ERβ免疫組化染色結(jié)果Fig.1 Result of ERαand ERβimmunohistochemical staining

表3 ERα、ERβ蛋白IHS結(jié)果（x±s）Tab.3 r ESULTS of ERα，ERβ protein IHS（x±s）

而本研究結(jié)果表明，ERα和ERβ在育齡期、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中均有表達(dá)，但表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERα的表達(dá)水平較育齡期婦女顯著下降，而且隨著年齡的增長(zhǎng)及絕經(jīng)年限的延長(zhǎng)，絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERα的表達(dá)水平較圍絕經(jīng)期婦女顯著下降，但圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβ的表達(dá)水平較育齡期婦女顯著升高，而且絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβ的表達(dá)水平高于圍絕經(jīng)期，說(shuō)明絕經(jīng)影響陰道組織中ER的表達(dá)。本研究結(jié)果與Fu等人研究基本一致，ERα在所有婦女的陰道壁組織中均有表達(dá)，絕經(jīng)后ERα的表達(dá)降低且與絕經(jīng)時(shí)間表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，隨著絕經(jīng)時(shí)間延長(zhǎng)，ERα的表達(dá)大幅度下降；Fu等研究表明，ERβ在絕經(jīng)前后均有表達(dá)，但表達(dá)未見明顯差異，本研究也證明ERβ在絕經(jīng)前后婦女陰道組織中有表達(dá)，然而，表達(dá)似乎受到絕經(jīng)的影響。上述研究結(jié)果不一致的原因考慮與年齡、絕經(jīng)年限、研究方法有關(guān)，正如Ewies等[14]描述不同絕經(jīng)時(shí)期和陰道脫垂均影響陰道組織中ER的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)揭示了不同絕經(jīng)時(shí)期患者陰道組織中ERα和ERβ的表達(dá)形式不同，說(shuō)明兩者在介導(dǎo)雌激素作用方面有不同的功能，是造成雌激素作用的組織特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)，了解不同絕經(jīng)狀態(tài)患者陰道組織中ER的表達(dá)變化，可針對(duì)特定的受體亞型治療絕經(jīng)后婦女泌尿生殖道疾患，為絕經(jīng)后婦女泌尿生殖道疾患的雌激素治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。