商陸皂苷甲對IL-17誘導腎小球系膜細胞增殖的影響*

湯杰印，張 薇，張祥貴，徐麗君

遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院腎內科(珠海519100)

腎小球系膜細胞(Glomerular mesangial cells,GMC)是腎小球內固有細胞之一，GMC大量增殖及其細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)分泌增多是各種增殖性腎炎的重要病理基礎[1-2]。白介素-17(Interleukin-17,IL-17)細胞主要是由輔助性Th17(T helper cell 17,Th17)合成并分泌的促炎因子，研究證實Th17及其分泌的IL-17參與多種腎臟疾病，尤其在增殖性腎炎的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[3-5]。IL-17可刺激GMC增殖合成并分泌纖連蛋白(Fibronectin,FN)，加速腎小球硬化的進展[6]。商陸皂苷甲(Esculentoside A,EsA)具有顯著的抗炎癥、抗腫瘤，調節(jié)免疫，抑制細胞增殖和促凋亡的作用[7-9]，具有重要研究價值。我們課題組前期通過體內實驗發(fā)現，EsA可下調狼瘡模型小鼠外周血TNF-α、IL-6的表達，抑制腎臟組織Bcl-2、PCNA表達并誘導Fas、FasL及Caspase-3的表達，促進了腎固有細胞的凋亡，抑制了腎組織的增生，改善了蛋白尿及腎臟的病理狀況[10-13]；體外實驗發(fā)現EsA可直接抑制GMC增殖、CDK2的表達及ERK1/2-AP1通路活化，上調了P27表達，抑制GMC細胞周期進程[14-18]，EsA還抑制了CD4+T分化Th17減少了IL-17分泌。考慮EsA可能是通過腎臟固有細胞(GMC等)及淋巴系統(CD4+T等)途徑來達到治療系膜細胞增殖性腎炎的作用，對于EsA在組織中的具體作用機制究竟是間接通過淋巴系統還是直接作用于腎臟GMC等固有細胞或是兩者皆有之來實現的，目前并不清楚。本研究觀察EsA對IL-17誘導的GMC增殖及其細胞外基質FN表達影響，探討EsA治療系膜細胞增殖性腎炎的可能機制。

材料和方法

1 材 料 rGMC株(HBZY-1)由CCTCC提供。商陸皂苷甲(上海源葉生物科技有限公司)，生產批號：KM0521CA14。IL-17(Prospec公司)，DMEM培養(yǎng)液、優(yōu)級胎牛血清(Thermo公司)，胰酶溶液(碧云天生物技術研究所)，噻唑藍、二甲基亞砜(Aladdin試劑)，磷酸鹽緩沖液(1×)(Thermo公司)，大鼠纖連蛋白酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒。

2 方法與分組

2.1 GMC培養(yǎng)：GMC株購回后，細胞培養(yǎng)液透明、清亮，倒置顯微鏡下見細胞單層鋪滿瓶底，呈梭形，適應性培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞2次，胰酶消化細胞，見細胞收縮變圓，片狀脫落時，加入10%FBS 的DMEM，終止消化，吹打成單細胞懸液，移入離心管里，800 次/min，5 min離心后，棄上清，將含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液3 ml加入離心管重懸細胞，分裝3個25 mm2培養(yǎng)瓶，即1∶3方式傳代，每瓶培養(yǎng)液加至5 ml并吹打均勻后放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)液，觀察細胞生長迅速，每72 h予以傳代。本實驗選用6～9代rGMC。

2.2 細胞實驗分組：在檢測IL-17對GMC增殖影響中，根據IL-17濃度分為：對照組(不加藥物干預)，IL-17(5 ng/ml)組，IL-17(10 ng/ml)組，IL-17(20 ng/ml)組，IL-17(50 ng/ml)組，IL-17(100 ng/ml)組共六組；在檢測EsA對IL-17誘導的rGMC增殖及其對FN表達影響中分為：對照組(加入IL-17)、干預組(加入IL-17、終濃度為5mg/L EsA)共兩組。

2.3 MTT法檢IL-17對GMC增殖的影響：取對數生長期GMC接種于96 孔板，先培養(yǎng)箱孵育24 h后使GMC同步化于G0期。對照組為加入5%FBS的DMEM，其余各組加入5%FBS的DMEM及相應濃度的IL-17，上述各組分別培養(yǎng)至24、48 及72 h時，換取新鮮培養(yǎng)液，每孔加入0.5%MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后結束培養(yǎng)，吸棄舊培養(yǎng)液，各孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩10 min，充分溶解結晶顆粒，用酶聯免疫檢測儀OD490值。實驗重復4次。

2.4 EsA對IL-17誘導的GMC增殖及其對FN表達的影響：按照上述方法，對照組加入IL-17及5%FBS的DMEM、干預組加入IL-17、終濃度為5 mg/LEsA及5%FBS的DMEM，培養(yǎng)各組細胞至24、48、72 h，仔細收集各組細胞上清液后室溫下備用，MTT法檢測各組細胞OD490值，實驗重復4次。FN的表達采用ELISA試劑盒檢測收集的各組細胞上清液，具體步驟按照試劑盒說明書進行檢測。

結 果

1 GMC生長形態(tài)的觀察 經傳代24 h后GMC伸張貼壁生長，2～3 d可鋪滿瓶底。倒置相差顯微鏡下觀察細胞多呈梭形，胞核居中呈卵圓形，生長密集時細胞間縫隙縮小甚至消失(圖1)。

圖1 正常GMC形態(tài)(×40)

2 MTT法檢測IL-17對GMC增殖的影響 與對照組相比較，IL-17各濃度組明顯促進了GMC增殖(P<0.05)，在各檢測時間點，IL-17各濃度組對GMC增殖的影響無統計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 不同濃度IL-17對GMC增殖的比較

注：與對照組比較，*P<0.05

3 EsA對IL-17誘導的GMC增殖及其分泌纖連蛋白的影響 與對照組比較，干預組抑制了GMC增殖(P<0.05)，并明顯減少了FN表達(P<0.05)，見表2、3。

表2 商陸皂苷甲對IL-17誘導的GMC增殖的比較

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 商陸皂苷甲對IL-17誘導的GMC分泌FN水平的比較(ng/ml)

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

IL-17主要是由Th17細胞合成、分泌的細胞因子，在體內其與其受體結合后，可促進多種細胞分泌多種生長因子和趨化因子(如IL-1、IL-6、生長調節(jié)因子-α、單核細胞趨化蛋白-1等)；IL-17與IL-6等細胞因子協同作用后，放大局部炎癥效應；IL-17還具有強大募集炎性細胞(中性粒細胞、單核細胞等)的作用，并刺激炎性細胞產生IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和PGE2等炎癥因子，從而增強局部炎癥并引起免疫損傷[19]，參與了炎癥反應及自身免疫反應[20]，目前認為IL-17是一種重要的促進炎癥的細胞因子。研究發(fā)現IL-17可通過激活中性粒細胞及巨噬細胞來直接參與腎臟的炎癥反應，尤其在增生性腎小球腎炎中，IL-17A起著十分重要的作用[21]。Ig A腎病患者存在過量的IL-17，IL-17激活單核細胞釋放一系列細胞因子，如TNF-α、IL-1β，而TNF-α、IL-1β是重要的致炎因子，提示IL-17可能參與IgA腎病腎臟炎癥反應[22]，與非IgA腎病患者相比，IgA腎病患者外周血IL-17及TGF-β1表達上調，且與新月體形成相關[23]。因此，IL-17在系膜細胞增殖性腎炎中起著十分重要的作用。GMC是位于腎小球毛細血管袢之間的一種固有細胞，與系膜基質構成腎小球系膜，在多種刺激后出現增殖失控，分泌大量ECM(主要為FN)及炎癥因子，后者又可進一步促進GMC增殖以及ECM的分泌增多，形成惡性循環(huán)加重了腎小球損害是各種系膜細胞增殖性腎病的重要病理基礎[1]。IL-17可以刺激GMC增殖及基質彌漫增生[24]。本實驗結果顯示：與對照組相比較，IL-17各濃度組均明顯促進了rGMC增殖(P<0.05)，與既往研究相符[6]，提示IL-17誘導GMC增殖的實驗模型成功。但本實驗濃度范圍內IL-17對GMC增殖影響未見濃度、時間的依賴性，可能與IL-17實驗濃度篩選或檢測時間點等因素有關，有待進一步實驗研究。

EsA是從中藥商陸的塊根中提純而得到的一種三萜類皂苷化合物。既往研究顯示EsA具有調節(jié)免疫、抗炎、抑制細胞增殖和促進凋亡等作用。小劑量EsA可降低巨噬細胞的吞噬能力，并抑制其釋放IL-1、PGE2等[25]，但大劑量的EsA有明顯的肝、腎毒副作用[26]。我們課題組既往通過體內、外實驗證實了EsA可明顯改善狼瘡模型小鼠的尿蛋白及腎臟的炎癥，EsA可抑制GMC增殖，從而改善了狼瘡模型小鼠病情。FN是GMC外主要基質，是GMC纖維化標志性指標，有研究顯示IL-17可刺激GMC合成并分泌FN，且IL-17與FN呈劑量依賴性，從而加速腎小球硬化的發(fā)展[6]，HMCL均不表達IL-17，但IL-17可促進HMCL分泌IL-1β，且隨著IL-17濃度及時間呈依賴性[27]。本實驗結果顯示：干預組明顯抑制了GMC增殖(P<0.05)并降低了細胞外基質FN表達(P<0.01)，從而證實了EsA可抑制IL-17誘導的GMC增殖，并減少ECM的分泌。其可能的作用機制是：IL-17的受體幾乎表達于所有的細胞表面，IL-17與其受體結合后，主要信號傳導途徑有3條，首先可通過活化NF-KB，促使NF-KB速易位入核，啟動轉錄及蛋白的合成[28]；其次，IL-17可通過蛋白激酶MApK信號傳導通路發(fā)揮調控細胞周期等生理作用[29]；最后一條傳導信號途徑是JAKS/ STATs[30]，而EsA能通過刺激分泌干擾素以及抑制NF-KB和絲裂原等來發(fā)揮抗炎作用。結合我們既往的研究結果，EsA可抑制CD4+轉化Th17并抑制了其分泌的IL-17誘導的GMC增殖并下調了FN表達，從而改善了系膜細胞增殖性腎炎的病情，因此，EsA既可直接抑制GMC增殖也可通過淋巴系統(Th17，IL-17)間接作用于GMC，表明了EsA對系膜細胞增殖性腎炎的治療作用是多途徑多效應的，具體機制有待今后進一步研究。

本實驗結果表明，EsA可抑制IL-17對GMC的增殖，并減少FN的分泌，為EsA治療系膜細胞增殖性腎炎研究奠定了新基礎。