利樞針刺法對局灶性腦缺血大鼠Jagged1蛋白表達的影響*

惠建榮，張 瑞

1.陜西中醫藥大學(咸陽712046)；2.陜西中醫藥大學附屬醫院 (咸陽712083)

目前，腦卒中已經成為世界各國的常見和多發疾病，對全人類的健康和生命產生了巨大的威脅，其發病特點可概括為“四高一多”(高發病率、高致殘率、高死亡率、高復發率、并發癥多)[1-4]，它與心臟病、惡性腫瘤成為了導致人類死亡的三大主要因素。缺血性和出血性是腦卒中的兩大主要類型，目前缺血性腦卒中在臨床上較為多見，約占全部腦卒中的2/3[5-6]。目前，Notch信號通路在中樞神經系統疾病的發生、發展中的研究已受到廣泛關注。其中Notch信號通路參與腦缺血后神經功能恢復機制的研究正日益受到重視，前期已有研究表明Notch信號轉導通路對缺血性腦損傷后源性神經元的增殖和分化發揮關鍵調控作用，因而備受關注。

本次實驗中，在“少陽主樞”的理論基礎上提出利樞針刺法，選取少陽經的穴位外關、陽陵泉，并從行為學、細胞及分子學等方面觀察利樞針刺法對模型大鼠Notch信號通路Jagged1蛋白表達的影響及作用機制，從而探討利樞針刺法是否可通過激活Notch信號通路，促進內源性神經干細胞的增殖、分化及腦缺血后受損神經元的再生，以揭示利樞針刺法在腦缺血治療中的作用機理，為現代醫學治療腦缺血提供新的思路及方法。

材料和方法

1 實驗動物 選取健康雄性SD大鼠60只，體重200～250 g，實驗動物合格證號：SCXK(陜) 2012-003，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。

2 主要儀器、試劑及藥物 電子天平(上海，型號：FA2004A)、電熱恒溫水槽(上海，型號：DK-8AD)、臺式離心機(湖南，型號：TL-4)、內切式勻漿機(寧波，型號：XHF-D)、全自動酶標儀(美國，型號：EON)；兔抗鼠Jagged1多克隆抗體、β-actin、HRP-山羊抗兔IgG、RIpA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白預染 marker均購置于武漢博士德生物有限公司，胞二磷膽堿購置于齊魯有限公司。

3 動物分組及干預方法

3.1 大腦中動脈阻塞(Middle cerebral artry occlusion，MCAO)造模及分組：造模前大鼠適應性喂養1周。術前均禁食12 h，后選取10只大鼠只游離頸總動脈、頸外動脈，頸內動脈作為假手術對照組，剩余50只大鼠參照Zea-Longa等[7]的方法以線栓法制作MCAO局灶性腦缺血模型。將麻醉大鼠仰臥位固定，用手術刀在頸部正中切口，沿右側頸部肌肉及筋膜分離出右側頸部動脈(頸內、頸外、頸總)，把頸外動脈結扎后于近心端將頸總動脈結扎，并將頸內動脈用微動脈夾夾閉。用剪刀在頸總動脈分叉約3 mm處剪一小口，將制備好的魚線插入頸內動脈，將拴線緩慢推進，插入深度約在18 mm時將微動脈血管夾取下，在切口稍上方部位結扎，消毒，縫合切口，MCAO模型即完成。后將模型制備成功大鼠隨機分為模型對照組、利樞機針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組。

3.2 干預方法：假手術組、模型對照組每日抓拿1次，常規消毒外關、陽陵泉2個穴位；利樞針刺組，針刺外關、陽陵泉，穴位定位參照《實驗針灸學》[8]并結合人體同身寸取穴法；普通針刺組，針刺百會、大椎(按高等針灸學教材7版取穴)；西藥灌胃組給予胞二磷膽堿0.4 g/kg用生理鹽水稀釋至2 ml灌胃。

針刺方法：穴位常規消毒后，選用0.5寸毫針刺入，其中外關直刺2 mm，陽陵泉直刺6 mm，百會向前斜刺2 mm，大椎直刺5 mm，留針時間15 min，留針期間施平補平瀉手法1次。各組治療以24 h為1個周期，1次/d，連續治療14 d。

4 觀察指標及方法

4.1 神經功能缺損評分：參照Zea-Longa[7]的評分標準，分別于造模后的1、3、7及14 d對模型大鼠進行評分。4分：不能自發行走，昏睡、意識喪失、痙攣；3分：行走時向左側傾倒；2分：行走時向左側轉圈；1分：無法完全伸展左側前肢；0分：無神經缺損癥狀。除假手術組外，術后1 d神經功能評分在1～3分表示造模成功，0分和4分表示造模失敗，予以剔除。

4.2 腦梗死體積百分比的測定：干預結束后，各組各選大鼠5只，麻醉后灌注取腦，于-20℃冰箱冰凍約15 min后進行冠狀切片(每片約2 mm)，將切好的腦片置于1%的TTC(取1 gTTC粉末，用PBS充分溶解后定容到10 ml)溶液中，在37℃恒溫孵育箱內放置20 min，使之均勻染色。之后用4%的多聚甲醛進行固定，在低溫下(4℃)固定24 h后用數碼相機進行拍照，無梗死區域為粉紅色，有梗死區域則為白色。采用Adobe photoshop7.0圖像處理軟件測定每一片腦組織的梗死面積，根據相應公式[校正腦梗死體積百分比=(對側腦組織體積-缺血側正常腦組織體積)÷對側腦組織體積×100%]計算梗死面積。

4.3 Jagged1蛋白表達測定:采用WB(Western blotting)測定Jagged1蛋白的表達，將各組剩余的5只大鼠，于干預結束后取右側大腦海馬，提取總蛋白后采用BCA法測定蛋白濃度。變性后取40 μg電泳分離，轉移到PVDF膜上，室溫封閉1 h，加入兔抗鼠Jagged1多克隆抗體，4℃封閉過夜。第二天從4℃取出膜，洗膜3次，每次10 min，后加入HRP標記的二抗(1∶5000)，室溫輕搖1 h，洗膜3次，每次10 min，后用ECL顯影，于暗室中感光，定影后利用凝膠自動分析成像軟件分析結果，以β-actin為內參照，對結果進行分析。

5 統計學方法 采用SPSS19.0 統計學軟件統計分析，檢測數據采用均數±標準差表示，作單因素方差分析和t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 各組大鼠術后1、3、7及14 d神經功能缺失計分及其比較，神經功能評分統計學結果顯示：假手術組無神經功能的缺失，其他各組神經功能的評分在術后1、3 d下降無明顯差異，術后7、14 d下降比較明顯，利樞針刺組及普通針刺組在治療第14天后的神經功能評分顯著低于模型對照組、西藥灌胃組，有顯著性差異(P<0.01)；且利樞針刺組與普通針刺組比較也存在統計學差異(P<0.05)(圖1)。

2 TTC染色結果 各組模型大鼠腦組織經TTC染色可見：假手術組的腦片全部紅染，無蒼白梗死灶形成，模型對照組、利樞針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組大鼠的腦組織出現蒼白的梗死灶，提示造模成功。四組與假手術組對比(P<0.01)，差異顯著；利樞針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組三組分別與模型對照組比較(P<0.01)，具有顯著差異；利樞針刺組、普通針刺組分別于與西藥灌胃組對比(P<0.01)，差異有顯著性；將兩個針刺組進行對比(P<0.01)，有明顯差異。術后14 d，分別對各組大鼠的腦組織進行TTC染色，染色圖片(圖2)，梗死體積百分比結果(圖3)。

3 各組大鼠Jagged1蛋白的表達 對缺血性模型大鼠治療14 d后，經Western blot檢測后，各組Jagged1的表達結果顯示，各組治療14 d后Jagged1的表達，余四組與假手術組相對比，Jagged1的表達均增多，其中模型對照組與之存在統計學差異(P<0.05)，利樞針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組分別與假手術組對比(P<0.01)，差異有統計學意義；將利樞針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組分別與模型對照組對比(P<0.01)，差異仍具有顯著性；利樞針刺組、普通針刺組分別與西藥灌胃組對比(P<0.01)，差異也十分明顯；兩個針刺組之間對比也存在統計學意義(P<0.05)(圖4、5)。

圖1 神經功能缺失評分

圖2 各組大鼠腦組織TTC染色

圖3 腦梗死體積百分比

圖4 Western blot檢測Jagged1蛋白的表達

圖5 Jagged1蛋白的表達

討 論

通利樞機針刺法是以“少陽主樞”、“少陽樞機不利”為理論基礎的，作為六經之一的少陽，可以協調運轉太陽及陽明的功能，對于陰陽的平衡、表里的開闔同樣也發揮著重要的作用，故曰“少陽主樞”。調節全身陽氣出入、調節人體氣機升降、調節人體陰陽的出入則是少陽樞機作用的三個主要方面。只有少陽樞機作用發揮正常的調節作用，使人體氣機出入正常，升降自如，開闔有度，機體的生命活動才得以正常進行，協調運轉，取少陽經穴以通利樞機，血脈流行正常，則一切中風之象，自可消除。本實驗針刺選穴外關與陽陵泉，其中外關穴為手少陽三焦經脈上的絡穴，且與足少陽膽經的足臨泣通陽維脈，陽維主諸陽，可以調節全身陽經經氣，所以取外關能治療下肢的病證，還能調節全身氣血及陽經陽氣。陽陵泉不但是足少陽膽經的合穴，也是膽腑的下合穴，總的來說有宣發和疏調之的功效，故一者可以治療本經病，二者能治療膽腑的病變，三者還可治療筋脈麻痹。由于氣機升降逆亂是中風發生的關鍵，故取陽陵泉能調整其升降失衡之氣機，同時該穴為八會穴之筋會穴，能柔筋舒筋，通調氣血，通痹止痛，常用于中風偏癱的治療。

Notch信號通路是一種經典的信號通路，該通路的家族成員結構上具有高度的保守性[9]。Jagged1是表達于血管內皮細胞和平滑肌細胞中的特異性單次細胞跨膜蛋白，它是細胞膜上Notch受體的關鍵配體。研究表明，Jagged1表達的增加可以促使星形膠質細胞分泌多種神經營養因子，達到修復神經元以及促進其再生的作用，從而使神經元的存活率提高[10]。

本實驗為了探討利樞針刺法對于Notch信號通路中配體Jagged1的表達的影響以及作用機制，從行為學、細胞及分子水平進行了觀察，發現利樞針刺法可以改善腦缺血大鼠神經功能缺失評分以及大腦梗死面積，并提示利樞針刺可增加Jagged1的表達，激活Notch信號通路，從而使NSCs更多的向神經元分化以促進大鼠腦缺血后海馬區域神經干細胞再生以發揮神經修復作用，從而達到治療腦缺血的治療作用。