掌葉半夏有效提取物對(duì)宮頸癌大鼠癌組織中Survivin、Caspase-3及Caspase-7的影響

徐東英，馮相珍

河南省濮陽(yáng)市婦幼保健院婦產(chǎn)科(濮陽(yáng) 457000)

宮頸癌是婦科較常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其主要是因?qū)m頸先產(chǎn)生上皮內(nèi)瘤變，然后逐漸進(jìn)展至上皮下基膜的間質(zhì)，形成宮頸癌[1-2]。宮頸癌發(fā)生的因素有多種，主要與早婚、性生活習(xí)慣、HPV病毒感染(高危型)及分娩次數(shù)有關(guān)。宮頸癌早期大多無(wú)明顯癥狀，少部分患者可發(fā)生陰道分泌物異常或發(fā)生陰道接觸性出血等。很多患者到晚期才表現(xiàn)為陰道不規(guī)則出血或繼發(fā)癥狀。有資料顯示[3]，中國(guó)宮頸癌患者逐年增多，且有年輕化趨勢(shì)。因此尋求治療宮頸癌的藥物是目前研究的熱點(diǎn)。掌葉半夏對(duì)宮頸癌有抑制作用，但對(duì)其作用機(jī)制的研究臨床上較少。本研究探討掌葉半夏有效提取物對(duì)宮頸癌大鼠癌組織中Survivin、Caspase-3、及Caspase-7的影響，以為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

材料和方法

1 材 料 Wistar 大鼠50只，雌性SPF級(jí)，6周齡，平均體重(151.2±13.4)g，由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為：SCXK(滬)2014-0002；掌葉半夏提取物由上海中科院藥物所提供，由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的二甲基亞砜溶解，并用生理鹽水(無(wú)菌)稀釋?zhuān)F(xiàn)用現(xiàn)配；人宮頸癌Hela細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究所提供；DAB顯色劑、兔抗人兔抗人Survivin抗體、兔抗Caspase-7 抗體、Caspase-3抗體均由Cell Signalling Technology公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立宮頸癌大鼠模型:50只大鼠中隨機(jī)抽取10只作為對(duì)照組，其余40只進(jìn)行造模(根據(jù)趙亞麗制造宮頸癌模型的方法)[4]。取人宮頸癌Hela細(xì)胞(在無(wú)菌操作下)放置于RPMI-1640培養(yǎng)液(由2%谷氨酸鈉與10的胎牛血清組成)中，培養(yǎng)環(huán)境：溫度37℃，5%的體積分?jǐn)?shù)、CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h，用胰酶消化細(xì)胞(0.25%)、體積分?jǐn)?shù)是10%的小牛清培養(yǎng)基進(jìn)行終止消化。離心以1200 r/min的速度，10 min，洗滌后將細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整至107/ml，用無(wú)菌針管抽人宮頸癌Hela細(xì)胞的混懸液，并在大鼠腋窩處進(jìn)行皮下注射(0.5 ml)，常規(guī)飼養(yǎng)7 d，有腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)，證明造模成功(共36只)，將造模未成功的4只大鼠剔除。

2.2 分組及用藥:將造模成功的36只大鼠隨機(jī)分為三組(n=12)，各組(包括對(duì)照組)均給予純凈水及混合飼料飼養(yǎng)，自行飲食。模型組未進(jìn)行任何治療，陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行順鉑2 mg/kg腹腔注射，觀察組使用掌葉半夏有效提取物40 mg/kg灌胃，均1次/d，連續(xù)使用8周。

2.3 腫瘤體積測(cè)量:用藥8周后，將大鼠處死，取宮頸癌病灶，測(cè)量其長(zhǎng)、寬、高，計(jì)算出其體積。Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表達(dá)檢測(cè):用Western blot法。將各組大鼠處死，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、觀察組取腫瘤組織50 g，對(duì)照組取腋下皮下組織50 g，置入PBS緩沖液洗滌后，經(jīng)研磨及離心，用PBS(冰冷)洗滌細(xì)胞3次，放入裂解液并搖勻，再置于水中(4℃)冰浴30 min，離心(1200 r/min)10 min，取上清即得胞質(zhì)蛋白。然后進(jìn)行蛋白定量分析(用BCA法)。樣品蛋白量調(diào)整至30 μg～40 g，進(jìn)行分離(SDS-PAGE凝膠電泳)，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜。PBST洗膜5 min，并用其溶解后封閉PVDF膜2 h，分別滴加兔抗人Survivin抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人caspase-7抗體(比例均為1∶100)，在溫度為4℃環(huán)境下靜置12 h，然后用PBST再洗滌3次，10 min/次，隨后加入二抗，在室溫下孵育2 h，用PBST洗滌3次，10 min/次。用ECL將PVDF膜顯色，進(jìn)行X線曝光，以凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果讀取與分析。

結(jié) 果

1 各組腫瘤病灶體積分析 與模型組比較，觀察組及陽(yáng)性對(duì)照組長(zhǎng)、寬、高、體積均明顯降低(P<0.01)；觀察組長(zhǎng)、寬、高、體積與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組腫瘤病灶體積分析

注：與模型組比較，*P<0.01

2 Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表達(dá) 模型對(duì)照組 Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組與模型組比較，Survivin蛋白表達(dá)明顯降低，Caspase-3及Caspase-7蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；觀察組 Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表達(dá)與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

3 癌病灶體積與相關(guān)凋亡蛋白之間的相關(guān)性 由Pearson性分析可知，癌病灶體積隨Survivin蛋白表達(dá)升高而增大，呈正相關(guān)(r=0.821，P<0.01)；癌病灶體積與Caspase-3及Caspase-7蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.876、-0.901，P均<0.01)。

表2 Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

討 論

宮頸癌在婦科屬于最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其主要因?qū)m頸上皮發(fā)生內(nèi)瘤變而致。對(duì)于宮頸癌ⅡA期前(包括ⅡA期，根據(jù)FIGO分期)的患者大多主張手術(shù)結(jié)合放化療進(jìn)行治療，并取得了良好效果。研究證明[5-6]，惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展一方面與細(xì)胞增殖關(guān)系密切，另一方面與細(xì)胞凋亡明顯減少也密切相關(guān)。凋亡細(xì)胞的作用主要是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞的增殖與細(xì)胞的凋亡一直處于平衡狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞凋亡抑制因子表達(dá)明顯升高、細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子表達(dá)明顯降低時(shí)，細(xì)胞增殖與凋亡間的平衡就容易被破壞，出現(xiàn)細(xì)胞無(wú)限的增殖與生長(zhǎng)，最終發(fā)生腫瘤。所以，提高腫瘤組織中凋亡促進(jìn)因子、下調(diào)其凋亡抑制因子，恢復(fù)增殖與凋亡間的平衡對(duì)惡性腫瘤的治療意義重大。

Survivin屬于一種細(xì)胞凋亡抑制因子，其主要作用是阻滯凋亡促進(jìn)因子酶原向活性凋亡促性因子轉(zhuǎn)化，從而使細(xì)胞凋亡受到抑制。其在健康人體組織中一般表達(dá)甚低，在惡性腫瘤組織中則呈高表達(dá)，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有很重要的作用。張明發(fā)等[7]的研究中顯示，Survivin在正常人體中呈低表達(dá)，在宮頸CIN組織中呈現(xiàn)中等表達(dá)，在宮頸癌組織中則呈現(xiàn)高表達(dá)。也有研究[8]將Survivin表達(dá)視為惡性腫瘤輔助診斷及判定預(yù)后的重要指標(biāo)之一。Caspase-3及Caspase-7均為Caspase家族的成員，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主要作用。人體中大多細(xì)胞的凋亡離不開(kāi)細(xì)胞凋亡因子的誘導(dǎo)，若凋亡促進(jìn)因子受到抑制，則細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡間會(huì)失去平衡，導(dǎo)致腫瘤形成。當(dāng)下調(diào)Survivin(凋亡抑制因子)表達(dá)時(shí)，Caspase(凋亡促進(jìn)因子)則明顯上調(diào)，從而加快了細(xì)胞的凋亡。

掌葉半夏在科屬分類(lèi)上屬天南星科，以塊莖入藥。最早在20世紀(jì)70年代由復(fù)旦大學(xué)的附屬醫(yī)院將掌葉半夏治療宮頸癌，結(jié)果顯示其在宮頸癌抑制方面效果顯著，且無(wú)發(fā)生毒性作用及不良反應(yīng)。接著又進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，結(jié)果顯示，掌葉半夏能夠使抑癌基因P53上調(diào)、使癌基因E6表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。細(xì)胞凋亡因子有多種，本研究探討掌葉半夏對(duì)細(xì)胞凋亡因子Survivin、Caspase-3及Caspase-7的影響[9]。在本研究中，模型組癌組織中Survivin表達(dá)明顯高于對(duì)照組，Caspase-3及Caspase-7表達(dá)明顯低于對(duì)照組，這說(shuō)明這些相關(guān)細(xì)胞凋亡因子在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用。而使用掌葉半夏的觀察組能明顯降低Survivin表達(dá)，升高Caspase-3及Caspase-7表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖阻斷，癌病灶生長(zhǎng)延緩或停止，最終導(dǎo)致腫瘤體積縮小，發(fā)揮抗腫瘤作用。從本研究結(jié)果看，Survivin表達(dá)與癌病灶體積呈正相關(guān)，與Caspase-3及Caspase-7表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，此結(jié)果與高艷[10]的研究一致。

綜上所述，掌葉半夏有效提取物能使宮頸癌大鼠病灶的體積縮小，其作用機(jī)制可能與降低癌組織Survivin表達(dá)、升高Caspase-3、Caspase-7表達(dá)等細(xì)胞凋亡蛋白有關(guān)。