肺炎支原體感染患兒機體免疫功能分析

陳育華 周碧云 梁斯鍶 廖德權 霍恕婷

(廣東醫科大學附屬醫院：1.檢驗科；2.介入病區；3.骨科一區，廣東 湛江 524001)

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是引起人類呼吸道感染的常見病原體，在小兒呼吸道疾病中肺炎支原體的感染率逐年升高,患兒感染后引起以發熱、流涕、鼻塞、咽 痛、咳嗽為主要癥狀的上呼吸道感染癥狀[1]，還能引發間質性肺炎和其他肺外并發癥。多數學者認為除了病原體的直接侵害，還能引起機體細胞免疫功能和體液免疫功能紊亂。本文對2018年1月-2018年8月廣東醫科大學附屬醫院的46例Mp患兒進行了T細胞亞群、B細胞、NK細胞、白細胞分類、免疫球蛋白、C反應蛋白、補體水平進行檢測，從而探討肺炎支原體感染機體后引起機體的免疫功能變化。

1 材料與方法

1.1研究對象 46例Mp 患兒均來自2018年1月-8月廣東醫科大學附屬醫院患兒。其中男26例，女20例，年齡3個月～10歲，平均年齡4.7歲，46例患兒血清學檢測Mp-IgM均為陽性。臨床表現均有發熱、流涕、咳嗽等上呼吸道感染癥狀。對照組1為50例與Mp感染患兒有相似臨床癥狀但血清學檢測Mp-IgM陰性的兒童，其中男28例，女22例。年齡2個月～10歲，平均年齡2.5歲，年齡、性別與實驗組均無統計學差異。對照組2為44例健康體檢兒童，其中男25例，女19例，年齡4～16歲，平均年齡5.8歲，年齡、性別與實驗組均無統計學差異。

1.2研究方法

1.2.1 T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞、NK細胞的檢測取CD3+-PC5、CD4+-PE、CD8+-ECD、CD(16+56+)-PE 和 CD3-CD19+-PE鼠抗人熒光單克隆抗體(由美國 Beckman Coulter 公司生產)各4 μl抗體(NK細胞和B細胞的檢測需要10 μl)加入試管中→再加入50 μl抗凝全血，充分混勻→暗處室溫(20～25 ℃)孵育 15 min→加Op-tilyse C 溶血劑 500 μl 溶血(37 ℃預熱)，混勻，避光放置15 min→再加入3 mlPBS，旋渦混勻后2500 r/min離心3 min→吸掉上清后再加500 μlPBS，混勻在流式細胞儀上檢測外周血中的 T 淋巴細胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+以及B淋巴細胞和NK細胞的表達率。

1.2.2 白細胞及白細胞分類的檢測采取Beckman Coulter LH750 全自動血細胞分析儀檢測白細胞總數及白細胞分類比例，嚴格按照儀器操作規程進行操作，試劑、校準品、質控品均為Beckman Coulter 公司提供。

1.2.3 免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、總IgE)、C反應蛋白、補體(C3、C4)的檢測 采用Beckman Coulter公司提供的 IMMAGE 800特定蛋白分析儀檢測患兒血清中免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、總IgE)、C反應蛋白、補體(C3、C4)。嚴格按照儀器操作規程進行操作，試劑、校準品、質控品均為Beckman Coulter 公司提供。

2 結果

2.1三組外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD3-CD19+檢測結果比較(見表1及圖1～圖5) 與對照組2比較，實驗組外周血CD3+T細胞比例、CD3+TCD4+T細胞比例、CD16+CD56+NK細胞比例明顯下降，CD3+CD8+T細胞比例明顯升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)。與對照組1比較，實驗組各項指標均沒有統計學意義(P>0.05)。

表1 三組全血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD3-CD19+檢測結果比較

備注：*與對照組2比較，P<0.05。

圖1 總T淋巴細胞流式散點圖

圖2 CD4+T淋巴細胞流式散點圖

圖3 CD8+T淋巴細胞流式散點圖

圖4 NK細胞流式散點圖

圖5 B淋巴細胞流式散點圖

2.2三組外周血白細胞總數、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞比例檢測結果比較(見表2) 與對照組2比較，實驗組白細胞總數增高，差異具有統計學意義(P<0.05。與對照組1比較，實驗組中性粒細胞比例增高，淋巴細胞比例減低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表2 三組外周血白細胞總數、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞比例檢測結果比較

備注：*與對照組2比較，P<0.05；△與對照組1比較，P<0.05。

2.3三組血清中免疫球蛋白、補體(C3、C4)、C反應蛋白檢測結果比較(見表3) 與對照組2比較，實驗組IgG含量下降，IgM含量、CRP含量上升，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與對照組1比較，實驗組IgM含量、IgA含量升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表3 三組血清中免疫球蛋白、補體(C3、C4)、C反應蛋白檢測結果比較

注：*與對照組2比較，P<0.05；△與對照組1比較，P<0.05。

3 討論

臨床上診斷肺炎支原體病，血清學抗體檢測法、核酸檢測法和MP培養法為主要檢測方法[2]。其中，MP分離培養及鑒定，仍然是確診MP感染的最重要手段。不過，由于肺炎支原體不易培養，臨床上很少用分離培養的方法鑒定呼吸道標本中的肺炎支原體，可以用血清學試驗中 IgM 抗體陽性作為臨床診斷標準。

CD3是成熟T淋巴細胞的表面標志，它作為主要免疫細胞參與機體的免疫應答,其數量的多少通常可作為判斷機體免疫狀態低下或過激的標準[3]。本研究顯示，CD3+T細胞明顯低于正常對照組，提示隨著患兒病情的加重，成熟T細胞數量下降越明顯，T細胞免疫功能下降。CD4是輔助性T淋巴細胞(Th細胞)的表面標志，具有輔助T、B淋巴細胞免疫應答的功能，可與MHCⅡ類分子結合，參與Th細胞第一活化信號的產生；而CD8是細胞毒性T細胞(CTL)的表面標志，與MHCI類分子結合，參與CTL細胞第一活化信號的產生。結果顯示MP患兒CD4+/CD8+較正常對照組下降，這是由于兒童感染MP后,機體所產生的抗體可與自身抗原結合形成抗原抗體復合物,引發免疫應答,產生炎性因子,導致除呼吸系統外的其他多個系統疾病的產生,從而使CD4+降低,CD8+升高,CD4/CD8比值倒置，機體免疫功能失調[4]。CD19是成熟B淋巴細胞的表面標志，CD16、CD56是NK細胞的表面標志，研究顯示MP患兒CD19+比正常對照組顯著增高，提示患兒體內B細胞異常活化增值，分泌大量抗體，參與體液免疫反應。NK細胞無需抗原致敏就能直接殺傷靶細胞，廣泛參與機體抗腫瘤、抗感染效應機制，并且僅殺傷異常細胞，對宿主正常細胞一般無細胞毒作用。MP患兒NK細胞比正常對照組顯著下降，提示患兒感染MP后NK細胞增殖受阻，使患兒感染期延長，本研究流式細胞儀檢測結果與鄧永超等[5-7]結果相同。

白細胞對調節人體免疫功能發揮重要作用，當白細胞水平急劇上升時，則反映出機體有炎癥的可能[8]。本研究顯示MP患兒全血中白細胞總數僅與對照組2有差異，這與陳士建[8]的研究結果不一樣，可能與本研究樣本例數不足有關。雖然白細胞數量會隨著MP的感染有一定的上升或下降，但受采血時間、個體差異、儀器狀況等臨床因素影響，一些MP患兒常出現血常規無明顯變化的情況。并且一些學者指出白細胞這些指標結果波動幅度大，波動幅度可達到 30%～50%[9]，對臨床診斷造成干擾。故除血常規之外，應結合其他指標綜合考慮MP患兒機體的免疫功能。

本研究中，MP患兒IgM明顯高于正常對照組，而IgG明顯低于對照組，提示 MP 感染后刺激機體免疫系統，可導致B淋巴細胞的的異常增殖、活化，產生特異性抗體和非特異性抗體。血清中檢出IgM提示患兒近期發生感染，可用于臨床早期診斷MP感染。有研究表明[5]，IgM在機體感染MP一周后產生，3-4周達頂峰。IgG較IgM出現時間較晚，血清中含量未增高可能與患兒所處感染階段有關。而Ig A含量增高，但與正常對照組比較差異無統計學意義(P<0.05)。陳開革等[10,11]認為，Ig A 可作為新近發生MP 感染的一個指標，在 MP感染早期迅速升高，其抗體水平的下降較 Ig G 和 Ig M 提前。出現這種差異可能與儀器、方法、采集時間、標本狀態不同有關。C3、C4含量增高但差異無統計學意義，提示MP患兒感染后，與激活補體有關。

C-反應蛋白是一種在肝細胞內合成的可以結合肺炎球菌細胞壁多糖的蛋白質[12]。CRP作為急性時相反應的一個極靈敏的指標，常在急性心肌梗死、創傷、感染、炎癥、外科手術、腫瘤浸潤時顯著地增高[13]。本研究MP患兒血清中CRP水平高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。與龔萍[12]等人研究結論相同，但CRP是非特異指標，當其血漿濃度升高一定程度時只能作為機體明顯的炎癥信號而不能特異診斷某種疾病。

總之，肺炎支原體感染患兒與健康兒童對比，存在細胞免疫和體液免疫功能紊亂，臨床醫生在治療患兒時，應適當采用免疫調理，縮短患兒病程，提高患兒的治病率。