TB-LAMP聯合夾層杯集菌離心涂片法快速檢測對提高塵肺合并結核陽性率的研究

吳志偉 張秀華 閆志偉 陳 娜 溫陳勇 龔 琴 賈愛福 郝世家 陳向東

1.河北省張家口市肺科醫院 呼吸內科、放射科、檢驗科(河北 張家口 075441 ); 2.河北省張家口市疾病預防控制中心 結核科(河北 張家口 075000)

肺結核是塵肺病最常見的合并癥，塵肺患者已被WHO列為肺結核高危人群。塵肺合并結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染后能促使塵肺進展，同時塵肺也能加重結核惡化，塵肺合并結核患者癥狀明顯較單一病種嚴重，死亡率明顯升高。及時發現塵肺合并肺結核，早診斷早治療，不僅能顯著降低病死率，也能延緩塵肺病肺纖維化進展[1]。MTB的實驗室診斷主要包括分子生物學診斷、細菌學診斷以及免疫學診斷，各有利弊[2]。由于塵肺病變中結核病灶被纖維組織包圍，使MTB不易經支氣管進入痰液，病灶周圍纖維組織收縮，引起支氣管扭曲、變形和閉塞，也不易隨痰中排出，因此塵肺合并結核患者痰MTB陽性率不高。為了進一步提高塵肺合并結核陽性率，我院特此對TB-LAMP聯合夾層杯集菌離心涂片法快速檢測進行研究分析。

1.資料與方法

1.1一般資料 選取我院在2018年1月-2019年1月就診的塵肺患者共150例作為研究對象，分別使用直接涂片法、BD960培養法、TB-LAMP及夾層杯集菌離心涂片法進行檢測。研究對象均為男性,年齡32～71 歲，平均年齡45.6歲,粉塵接觸工齡為3～31年，平均工齡(15.3±1.4)年。其中塵肺壹期40例，塵肺貳期45例，塵肺叁期65例。

1.2方法

1.2.1 標本的留取 按照《痰涂片鏡檢質量保證手冊》留取晨痰標本，囑咐患者用力漱口，清晨深咳痰約 3～5 ml置于3個密閉的無菌標本杯中，具體處理及保存方式嚴格按照相關檢查的操作流程。為提高檢測陽性率，在沒有禁忌癥的情況下，對沒有痰的患者通過吸入高滲性鹽水誘導痰或者進行纖維支氣管鏡檢收集BALF，然后進行痰涂片染色(包括直接涂片法和夾層杯法)、TB-LAMP檢測和結核桿菌培養。

1.2.2 直接涂片法 按照《痰涂片鏡檢質量保證手冊》將病人留取的痰首先做直接涂片、干燥，抗酸染色后鏡檢。

1.2.3 BD960培養法

1.3操作原理 該儀器培養管底部包埋有熒光顯示劑，直接感應培養管內氧氣濃度。當培養管內有分枝桿菌生長時，氧氣被消耗，熒光顯示劑在二極管的激發下發出熒光，BD 960熒光強度記憶探測器每隔60分鐘連續測定培養管內熒光強度，并通過數據處理得出陽性結果，以生長單位形式報告，并直接打印出結果。陽性培養管取出后直接涂片進行抗酸染色以確定是否為分枝桿菌。

1.4操作方法 將培養管在無菌條件下分別加0.8 ml混合液備用。送檢標本經常規消化去污染濃縮處理后，分別接種于培養基及已準備好的培養瓶和培養管中，將培養管置入BD 960全自動快速分枝桿菌培養鑒定藥敏儀孵育培養。BD 960熒光強度記憶探測器每隔60分鐘連續測定培養管內熒光強度，判斷管內分枝桿菌的生長情況。若出現陽性標本，儀器紅色指示燈立即閃亮，同時有報警提示音。按儀器操作步驟提示取出陽性標本，并自動打印出結果。

1.5TB-LAMP檢測 檢測試劑盒由日本榮研株式會社生產，采用環介導等溫擴增(LAMP)法：(1)采集痰液：將痰液樣本放入吸附劑試管中，加熱90℃裂解5分鐘；(2)DNA提取：將吸附試劑管裝到樣本處理管上，搖晃幾次后得到初提的核酸，在樣本處理管上加上滴注蓋，輕壓樣本處理管將樣本滴入到反應管中，時間大約5分鐘；(3)擴增和檢測：試劑干燥于蓋管上，蓋上蓋管，充分混合后即可進行LAMP反應，反應結束后將反應管放入紫外檢測器中觀察結果，時間大約40分鐘。

1.6夾層杯集菌離心涂片法

1.6.1 操作原理 標本通過消化液處理，滅活了抗酸桿菌活性，并且消除細胞和粘液干擾，運用符合光學一致性的離分子膜吸附技術，通過離心和膜主動吸附將抗酸桿菌吸附于膜上，經過自動或手工染色，將完成染色的標本膜片取出、直接在油鏡下人工或計算機輔助閱片。

1.6.2 使用方法 取患者晨痰>1 ml于痰杯中，在標本中加入2～4倍的標本消化液，后將消化好的標本進行震蕩，后移至自動離心涂片機中，棄上清液，置于片壩內烘干膜片表面水分，滴加無水乙醇數滴，數秒鐘，傾去多余的無水乙醇。滴加抗酸染色液A液5～7滴，干片機內加熱60℃左右染色保持5分鐘，小量流水沿杯壁輕輕沖洗，瀝干。滴加B液4～6滴色至無色，小量液水洗凈，瀝干，滴加C液4～6滴，染色1～3分鐘，水洗，瀝干。用取片針將離心吸附式夾層杯內膜片頂出、用鑷子夾出膜片，在吸水紙上輕輕印千表面水分，置于片機內徹底烘干、標本面向下，用中性膠封片鏡檢。

觀察指標及統計學分析 觀察對比4種檢驗方法MTB的陽性率，采用 SPSS 22.0 軟件對本次研究的相關數據進行處理，率以(n,%)表示，以χ2值檢驗數據間的差異，當P<0.05 時，認為數據差異具有統計學意義。

2 結果

150例塵肺患者最后結合臨床癥狀、體征、流行病學、影像學檢查、實驗室檢查等，經病例討論確診為塵肺合并結核的共45例。

2.1四種檢驗方法塵肺合并結核的MTB的陽性率比較 BD960培養法、TB-LAMP及夾層杯集菌離心涂片法對比直接涂片法的陽性率結果均差異有統計學意義，P<0.05，但是前三者之間陽性率結果沒有統計學差異，具體詳見表1。

表1 四種檢測方法塵肺合并結核的陽性率(n,%)

2.2隨著塵肺期別的提高，塵肺合并結核的比例也升高，MTB的陽性率也升高；BD960培養法、TB-LAMP及夾層杯集菌離心涂片法對比直接涂片法在塵肺叁期及總數上的陽性率結果均差異有統計學意義P<0.05，但是前三者之間陽性率結果沒有統計學差異，具體見表2。

表2 四種檢測方法不同期別塵肺合并結核的陽性率(n,%)

2.3快速檢測MTB的實驗室方法對比顯示：TB-LAMP聯合夾層杯集菌離心涂片法和直接涂片法檢測時間沒有統計學差異，都能在2個小時內報告結果，但是陽性率結果比較差異有統計學意義，P<0.01,具體見表3。

表3 快速檢測方法陽性率的對比

3 討論

目前臨床常用的快速檢測MTB的方法為直接涂片抗酸染色法，雖然檢測時間較短，特異性比較高，但敏感性較低。分枝桿菌的培養是診斷結核病的金標準，BD960具有快速分離培養結核分枝桿菌和其他分枝桿菌的優勢，陽性率明顯高于羅氏培養法且培養陽性時間大幅度縮短[3]，但培養結果仍需要4～29天才能獲得，達不到早期快速診斷的要求，因此尋找結核病的早期、快速的診斷方法是當前臨床的重要研究課題。

TB-LAMP 是由日本榮研化學株式會社開發的一種簡便、快速、價廉、敏感性及特異性高的基因擴增技術[4-5]。該產品具有在資源匱乏的基層實驗室實施的優勢：反應時間短(15～40 min)、在恒定溫度下進行擴增反應(無需復雜精密的儀器)、特異性高、不易受干擾物影響、結果可直接通過肉眼觀察判定，適合簡易性檢測等。報告稱與傳統的涂片和培養法相比，LAMP 技術優勢明顯，尤其是樣本檢測量大于 20 個/天時，TB-LAMP 具有高通量檢測優勢，不需要復雜精密的儀器和必要的生物安全設備，在現有的條件下即可有效提高結核病的檢出效率，缺點是TB-DNA不能區分MTB活性。該研究以痰涂片和培養法為標準，TB-LAMP 法的整體靈敏度達到 97.4%，特異性為 94.8%[6]。WHO于2016年8月11日，發布了一份最新的推薦書，推薦發展中國家的基礎醫療單位使用該方法，可以作為痰涂片檢測方法的替代方案。

夾層杯集菌離心涂片法是一種基于液基細胞學技術新開發的技術，是一種簡便的、人為影響因素少的方法，且有利于檢驗工作人員的生物安全防護和提高檢驗水平[7]。該方法比涂片法及培養法收集抗酸桿菌的范圍更廣泛，更完全[8]。實驗過程標準，能對抗酸桿菌檢測數量達到最小值；標本經中性膠封片，鏡檢時不直接接觸含菌面，避免了交叉污染；操作過程小環境處于密閉狀態，避免了氣溶膠的形成，提高了生物安全性；標本片子可更久保存，進一步滿足質控要求；檢測時間短，精度高，是涂片法的高級版本[9]。

本次研究針對TB-LAMP在塵肺合并活動性肺結核的臨床應用，提出以下建議：(1)LAMP(+)涂片(+...4+)，MTB感染可確診；(2)LAMP(+)涂片(-)，這時可考慮增加一個或一個以上的標本進行LAMP檢測或增加涂片的次數，來檢測二者的一致性。如果增加樣本的結果仍是LAMP(+)涂片(-)，則患者需要結合臨床癥狀、胸部CT以及塵肺合并結核的高發病率進行綜合判斷；(3)LAMP(-)涂片(+...4+)，這時可增加一個或一個以上的標本檢測，若增加的標本檢測結果仍不變，首先考慮LAMP結果是否受痰標本中的抑制物影響，其次考慮是否為非結核分枝桿菌(NTM)感染，必要時行相關檢測；(4)LAMP(-)，涂片(-)。首先考慮標本的質量，可以提高標本的質量，如氣管鏡取痰或BALF液等，如果最終二者結果均是陰性，那不考慮塵肺合并活動性結核可能。

本研究顯示TB-LAMP聯合夾層杯集菌離心涂片法快速檢測和直接涂片法陽性率結果比較差異有統計學意義(P<0.01)。TB-LAMP與夾層杯集菌離心涂片法的有效聯合，加快了檢測進程，計算單位體積內痰液中抗酸桿菌的數量更加準確，且操作簡便[10]。二者聯合最快捷、陽性率高、質控較好、檢測結果更具有代表性。本研究將結果顯示，TB-LAMP聯合夾層杯集菌離心涂片法快速檢測能明顯提高塵肺合并結核的陽性率，有利于結核病的早期診斷與治療，值得在有條件的醫院進行推廣應用。