miR-155在急性胰腺炎患者血漿中的表達及臨床意義

郭廣洋 王 宏

本溪市中心醫院(遼寧 本溪 117000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常見的急腹癥內科疾病之一，是由多種病因導致胰腺內胰酶被激活從而引發胰腺組織自身的炎癥反應[1]。急性胰腺炎主要包括輕癥急性胰腺炎(MAP)、中度重癥急性胰腺炎(MSAP)和重癥急性胰腺炎(SAP)[2]。AP 的臨床診斷主要結合急性胰腺炎臨床癥狀、血生化指標以及影像學檢查等，但這些診斷方法缺乏特異性，可能出現誤、漏診[3]。臨床上評估急性胰腺炎患者病情及預后常用的方法包括Ranson 評分、CT嚴重度指數(CTSI)評分等，各評分系統也均存在各自的優缺點。MicroRNA是一種非編碼RNA，可以調控靶基因表達，在免疫應答和炎癥反應過程中發揮重要的作用[4]。研究表明[5]，miR-155作為炎性調控因子在AP病理過程中發揮重要的作用，通過抑制 miR-155 在小鼠中的表達，能顯著改善小鼠胰腺的病理學損傷。本研究檢測急性胰腺炎患者血miR-155表達水平，為探討其作為早期預測及預后的血清學標志物提供實驗基礎。

1 方法

1.1對象和分組 選取我院2016年3月～2018年3月收治的40例急性胰腺炎患者為病例組，分為輕癥急性胰腺炎患者(MAP 組，n=20)和重癥急性胰腺炎患者(SAP 組，n=20)，并隨機選取同期20例健康體檢者為對照組(Con組，n=20)。

1.2材料和試劑 血清/血漿microRNA快速提取試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司、反轉錄及實時熒光定量PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司。

1.3血漿樣品的制備 空腹采集各組患者外周靜脈血5 mL，肝素鈉抗凝，4 ℃靜置1 h，2000 r/min，離心10 min，收集上清液置于RNase-free離心管中，保存于液氮中備用。

1.4血漿microRNA的提取及Real-Time PCR 應用microRNA快速提取試劑盒，按照試劑盒說明書步驟提取血漿中的microRNA，紫外分光光度計測量RNA濃度，取300 ng RNA樣品進行反轉錄，反轉錄后取2ul cDNA進行qPCR檢測，反應條件為：95°C預變性10sec，95°C5sec，60°C20sec，擴增40個循環。miR-155的相對表達量以試劑盒內的U6引物為內參，采用 2-△△ct法進行分析。miR-155引物序列為F:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTT-GAGACCCCTAT-3’，R:5’-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT-3’。

1.5急性胰腺炎病情嚴重程度評估 ①Ranson評分[6]：由入院時檢測的5 項指標以及入院48 h 時檢測的6 項指標組成，每項指標記為1分，總分<3 分為輕癥急性胰腺炎，總分≥3 分為重癥急性胰腺炎。②CT 嚴重程度指數(MCTSI)評分[7]，總分為10分，急性胰腺炎形態學改變依照MCTSI分為MAP(0～3分)、MSAP(4～6)和SAP(7～10分)

1.6統計學方法 采用SPSS 19.0 統計學軟件進行統計分析，計量資料數據用均數±標準表示，多組間獨立樣本比較采用方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P< 0.05有統計學意義。

2 結果

2.1三組患者血漿中miR-155表達水平的檢測 提取患者外周血漿microRNA，反轉錄后通過Real-Time PCR檢測miR-155的表達水平，采用 2-△△ct法進行分析，結果顯示：與對照組相比，MAP 組和SAP 組患者血漿miR-155表達水平升高(P<0.05)，且SAP 組miR-155表達水平高于MAP 組(P<0.05)(圖1)。

圖1 血漿miR-155Real-Time PCR檢測結果注:* 與Con組比較，P<0.05；#與MAP組比較，P<0.05

2.2血漿miR-155 表達與急性胰腺炎患者臨床特征的關系 AP患者外周血血漿中miR-155表達量與年齡、性別無關(P>0.05)，差異無統計學意義。不同Ranson 評分及MCTSI 評分的急性胰腺炎患者血漿中miR-155表達量不同，Ranson 評分≥3 分、改良的CT 嚴重指數(MCTSI)評分≥4 分，急性胰腺炎患者血漿miR-155表達水平高于Ranson 評分<3 分、MCTSI 評分<4 分，差異有統計學意義(P<0.001)見表1。

表1 急性胰腺炎患者臨床特征與血漿miR-155表達的關系

3 討論

急性胰腺炎是臨床上常見的炎癥性疾病之一，它不僅累及胰腺及周圍組織，治療不及時還可以誘發全身炎性反應綜合征、膿毒癥、休克以及多器官功能障礙綜合征等，病死率較高[8-9]。急性胰腺炎的主要臨床表現包括急性發作的持續性上腹部劇痛，常伴有背部放射性疼痛、惡心及嘔吐等。輕癥患者癥狀不明顯，主要表現為腹部輕壓痛，重癥患者表現為上腹部持續性刀割樣劇烈疼痛，可蔓延至全腹，出現腹膜刺激征[10]。急性胰腺炎的臨床表現呈現多樣性，能夠反映病情嚴重程度的臨床表現的特異性差，對于不良預后的預測敏感性低[11]。臨床上，實驗室各類血生化檢測指標常用于判斷急性胰腺炎病情的嚴重程度，如血漿 C 反應蛋白(CRP)、尿素氮、酯酶和淀粉酶等；但這些診斷方法也缺乏特異性，其他疾病如急性闌尾炎，腸梗阻等疾病也能引起類似酯酶和淀粉酶的增高的表現[12]。各類評分系統如 Ranson 評分、急性生理和慢性健康狀況評分(APACHEⅡ)評分、CTSI評分、急性胰腺炎床邊嚴重指數評分(BISAP)評分、胰腺炎結局預測(POP)評分系統等，也常用于判斷急性胰腺炎病情的嚴重程度及愈后，這些評分系統種類較多，各有優勢和缺點。一些評分系統如Ranson 評分、APACHE Ⅱ評分雖得到認可，但因其所涵蓋的因素較多，臨床應用較為困難，其他簡易評分如POP等，還缺乏足夠的驗證及研究，所以尋找特異性的生物標記物，對急性胰腺炎的早期診斷、病情評估、臨床治療及預后評價都具有重要的意義。

microRNA作為一種非編碼 RNA，與靶基因的 3′非編碼區結合，抑制靶基因mRNA 的翻譯，調控靶基因表達，在許多病理、生理過程中發揮重要的作用[13]。研究發現，一些microRNA可以作為急性胰腺炎診斷和預后潛在的生物標志物[14-16]。應用SAP小鼠動物實驗研究發現，在動物模型的胰腺和腸上皮細胞中，miR-155的表達顯著增高，通過抑制 miR-155的表達，能顯著改善小鼠胰腺的病理學損傷[5-17]，說明miR-155的表達與急性胰腺炎的發生密切相關。

本研究檢測急性胰腺炎患者血漿中miR-155的表達水平，結果顯示：與對照組相比，MAP 組和SAP 組患者血漿miR-155表達水平升高(P<0.05)，且SAP 組miR-155表達水平高于MAP 組(P<0.05)，隨著病情的嚴重程度增加，miR-155的表達增加，這表明miR-155有可能成為胰腺炎診斷的生物標志物。本實驗分析了miR-155表達與部分臨床特征的關系，發現AP患者外周血血漿中miR-155表達量與患者的年齡、性別無關，差異無統計學意義(P>0.05)。不同Ranson 評分及MCTSI 評分的急性胰腺炎患者血漿中miR-155表達量不同，Ranson 評分≥3 分、改良的CT 嚴重指數(MCTSI)評分≥4 分，急性胰腺炎患者血漿中的miR-155 表達水平高于Ranson 評分<3 分、MCTSI 評分<4 分的急性胰腺炎患者，差異有統計學意義(P<0.001)。

本研究通過檢測血漿miR-155作為診斷急性胰腺炎及鑒別其嚴重程度的生物學標記物，發現其在急性胰腺炎患者中高表達且表達程度與疾病嚴重程度呈現正相關，為進一步探討其作為早期診斷及預后的血清學標志物提供了實驗基礎。