一株自然發酵甘薯酸漿的促淀粉絮凝酵母菌的分離鑒定及其共凝集特性

季子非,王筱瑜,田 原,許云賀,郭浩男,邢 鋮,王淋楓,張莉力

(錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000)

酸漿法沉降淀粉在我國已有很長的歷史,酸漿是用加水磨漿的綠豆或甘薯制成后經產酸類微生物自然發酵而形成的淡黃色有酸味液體[1]。在傳統淀粉的生產過程中,加入酸漿會使淀粉乳中的淀粉顆粒立即凝聚,重力變大，淀粉迅速沉降,此時使用的酸漿就是一種絮凝淀粉的微生物絮凝劑。雖然傳統酸漿法制淀粉不如現代工業化生產效率高,但此法所得的粉條等制品口感更佳,故酸漿法在實際生產中依然有著廣泛應用[2-4]。張莉力等[5-6]研究發現,在乳酸菌的表層存在一類特殊功能性蛋白,可以特定識別和結合淀粉顆粒,并且可以把大分子量蛋白質分解為短鏈的肽類,使得蛋白質和淀粉的比重差增大,從而使淀粉加速下沉,蛋白類物質在上層清液中被分離。吳衍庸等[7]的研究中發現,酸漿中酸含量、pH及金屬離子等因素也會影響淀粉沉降效率。有些酵母菌能和乳酸菌共生,Freitas等[8]研究表明,當具有發酵乳糖性質的酵母菌與乳酸菌共生培養時,乳酸菌產酸性能會大幅增加,這可能是因為多種微生物在生長過程中的代謝產物可以被相互利用,其機制有待進一步研究。

微生物的共凝集現象在自然界中普遍存在,但目前這方面的研究主要集中在細菌與細菌間的共凝集,關于乳酸菌與酵母菌共凝集的研究較少。實驗前期已從自然發酵酸漿中分離出兩株對淀粉具有高絮凝活性的乳酸菌[9-10],乳酸菌的純培養液對淀粉具有較高的絮凝活性,但與自然發酵酸漿的絮凝活力相比仍有差距。在后期的研究中發現,酸漿中的一些酵母菌雖然不具有絮凝淀粉的活性,但將這些酵母菌接入乳酸菌發酵液后,可以明顯提高乳酸菌發酵液對淀粉的絮凝活性,并發現在淀粉沉降顆粒中乳酸菌和酵母菌存在普遍的共凝集現象。所以,本實驗從自然發酵的甘薯酸漿中分離了與副干酪乳桿菌共凝集作用較強的酵母菌,并探究了幾種影響二者共凝集的理化因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食品級甘薯、馬鈴薯 錦州新瑪特超市;副干酪乳桿菌L1 錦州醫科大學食品科學與工程學院食品微生物實驗室保存;MRS肉湯培養基、葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀 北京奧博星生物技術有限公司;氯霉素 合肥博美生物科技有限責任公司;DNA提取試劑盒(D2300) 北京索萊寶科技有限公司;PCR回收試劑盒(AP-GX-250) 愛思進生物技術(杭州)有限公司。

FA2104N型分析天平 蘭州中西儀器;BOXUN立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;JB-VS-1300超凈工作臺 金壇市鑫鑫實驗儀器廠;DHP-9082電熱恒溫培養箱 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;PHS-3B精密pH計 上海雷磁儀器廠;數碼生物顯微鏡 OLYMPUS CX-21;PCR儀 Applied Biosystems公司;T20MM立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 甘薯汁葡萄糖培養基:甘薯200 g洗凈切絲,加入蒸餾水1000 mL煮沸20 min過濾得甘薯汁,加入葡萄糖20 g氯霉素 0.2 g。甘薯汁肉湯培養基:甘薯200 g洗凈切絲,加入1000 mL蒸餾水煮沸20 min過濾得甘薯汁,加入酵母粉5 g,牛肉膏10 g,葡萄糖22 g,無水乙酸鈉5 g,K2HPO42 g。

1.2.2 自然發酵甘薯酸漿的制備 稱取500 g甘薯洗凈切絲,加入1500 mL涼開水,打漿機調至3檔運行45 s,間隔30 s,再用3檔打漿30 s,將打出漿過八層紗布后再用120目篩子過濾,得甘薯漿后將其轉入滅菌冷卻后的燒杯中,靜置30 min后去除約三分之二上清液,剩余薯漿攪勻,加水至原體積,20～30 ℃發酵12～24 h,每隔3～4 h攪拌1次[1]。

1.2.3 自然發酵甘薯酸漿的活化 甘薯榨汁制得甘薯漿,將其加入到1.2.2發酵的老漿中攪勻,再重復1.2.1去上清步驟以去除雜質,每隔24 h活化一次,直至上清液顏色由褐色變成青白色,有少量水沫,味變酸,pH3.5～4.0,且上清液加入甘薯淀粉乳中可快速沉降分層。

1.2.4 酸漿中酵母菌的篩選

1.2.4.1 初篩 采用稀釋平板涂布法,分離純化樣品中的酵母菌。用無菌蒸餾水將活化好的酸漿梯度稀釋為10-5、10-6、10-7三組濃度,各取0.1 mL涂布到氯霉素抗性的(0.2 g/L)PDA平板上,30 ℃培養48 h。挑取典型的酵母菌菌落并鏡檢,將初步判定為酵母菌的菌落接種到PDA平板上劃線分離,30 ℃下培養48 h。如此反復劃線純化2～3次,根據各菌落形態,直到確定為單菌落后編號。

1.2.4.2 復篩 將編好號的菌株接種到甘薯汁葡萄糖培養基中,30 ℃恒溫培養48 h,活化3代,8000 r/min離心10 min并重懸于無菌蒸餾水洗滌兩次,調整OD600至0.7備用。

副干酪乳桿菌L1接入甘薯汁肉湯培養基活化3代,30 ℃培養24 h,8000 r/min離心10 min并重懸于無菌蒸餾水洗滌兩次,調整OD600至0.7。將初篩得到的各株酵母菌分別與副干酪乳桿菌L1兩兩配對。將兩株配對菌的菌懸液各5 mL加入15 mL離心管中,旋渦30 s混勻,于30 ℃孵育24 h后取上清液,在600 nm處測定吸光值并計算共凝集率,公式如下。再從中選出共凝集率最高的菌株,鑒定菌種。

共凝集率(%)=[(OD600A+OD600B)-OD600(A+B)]×100/(OD600A+OD600B)

式中:OD600(A+B)為兩種菌液混合孵育后的吸光值,OD600A和OD600B分別為副干酪乳桿菌L1和酵母菌兩種菌懸液單獨孵育后的吸光值[11]。

1.2.5 酵母菌菌種鑒定

1.2.5.1 形態學鑒定 將上述篩選得到的酵母菌劃線接種于PDA平板上,30 ℃培養48 h,觀察其菌落顏色及形態,對該酵母鏡檢,在油鏡下觀察酵母菌的細胞形態。

1.2.5.2 生理生化實驗 糖發酵實驗:按培養液體積的2%分別加入葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、海藻糖于培養液中,分裝試管后再倒置各加入杜氏管一支,置于30 ℃下培養48 h,不加任何糖源做空白對照;氮源同化實驗:將脲、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨分別加入培養液分裝,不加任何氮源做空白對照,30 ℃培養48 h,觀察試管中是否渾濁;碳源同化實驗:加入碳源分別為葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、木糖、蔗糖,方法同氮源同化實驗[12]。

1.2.5.3 分子生物學鑒定 提取分離篩選所得的酵母菌DNA,進行PCR擴增26S rDNA,采用引物為26sF:5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3′和26sR:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR反應體系為50 μL,其中基因組DNA 1.0 μL,10×Buffer(Mg2+Plus)5.0 μL,Taq聚合酶(5 U/L)1.0 μL,dNTP(10 mmol/L)1.0 μL,正向和反向引物共3.0 μL,加去離子水(ddH2O)39.0 μL至50.0 μL。擴增程序為95 ℃預熱300 s,98 ℃解鏈30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共35個循環。反應完成后,取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。確認PCR擴增片段后將PCR產物送至上海派森諾生物科技公司測序。將測得的基因序列提交到Genebank進行同源性比較,最后用MEGA5.0軟件構建系統發育樹。

1.2.6 理化因素對酵母菌與副干酪乳桿菌L1共凝集特性的影響

1.2.6.1 菌懸液的制備 酵母菌活化后接入PDA液體培養基,30 ℃培養48 h,8000 r/min離心10 min收集菌體,無菌蒸餾水洗滌兩次后重懸,調菌懸液OD600至0.7左右備用。副干酪乳桿菌L1活化后接入甘薯肉湯汁培養基,30 ℃培養24 h,8000 r/min離心10 min收集菌體,無菌蒸餾水洗滌兩次后重懸,調菌液OD600至0.7左右備用。

1.2.6.2 緩沖液 制備菌懸液時,分別采用無菌蒸餾水和PBS(pH=7)重懸并調菌液OD600值至0.7,酵母菌和乳酸菌分別設置單菌對照,30 ℃靜止孵育,分別在4、24 h取上清液測OD600,根據1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數據。

1.2.6.3 溫度 將菌懸液調OD600值至0.7,單菌對照,分別置于20、35、50、65 ℃下孵育,在4、24 h取上清液測OD600,根據1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數據。

1.2.6.4 pH 將離心收集的菌體用pH分別為3、5、7、9的無菌蒸餾水重懸沉淀,制備成不同pH環境下的菌懸液。調菌液OD值至0.7,單菌對照,30 ℃靜止孵育,分別在4、24 h取上清液測OD600,根據1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數據。

1.2.6.5 超聲處理 將菌懸液調OD600至0.7,置于100 W超聲振蕩器中振蕩30 s,與靜置組互為對照,30 ℃靜置孵育,分別在4、24 h取上清液測OD600,根據1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數據。

1.2.6.6 生長期 酵母菌培養時間分別取12、24、36、48 h共4組,副干酪乳桿菌L1均培養24 h,其余條件不變,根據1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數據。

1.3 數據處理

使用SPSS 19.0軟件中的ANOVA單因素方差分析及LSD多重檢驗,對數據進行統計處理和差異顯著性分析(p<0.05),數據的表示方式為:平均值±標準差(n=3)。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離純化、篩選及形態學鑒定

從活力良好的自然發酵甘薯酸漿中,采用PDA培養基從樣品中共分離出88株酵母菌,通過菌落和形態觀察及參考《酵母菌的特征與鑒定手冊》[13]對酵母菌進行初步鑒定,再通過測定共凝集率篩出與副干酪乳桿菌L1共凝集率最高的一株菌9#,其共凝集率為67.2%±0.12%。如圖1a,該菌菌落呈乳白色,菌落表面光滑濕潤,邊緣整齊,橢圓微凸。圖1b菌個體呈長圓形,鏡檢時有明顯芽殖現象,圖1c、圖1d可見該菌與副干酪乳桿菌L1明顯的黏附現象。

圖1 9#酵母菌形態及共凝集狀態

2.2 生理生化實驗

同化實驗反映酵母菌菌種對不同碳源和氮源的利用能力,糖發酵實驗反映了酵母菌對糖的利用能力。表1可以看出,9#菌可以發酵乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和海藻糖,不能發酵木糖;該菌可以同化葡萄糖、果糖和蔗糖,但不能同化木糖、麥芽糖和乳糖;該菌可以同化硫酸銨、氯化銨、蛋白胨和脲。通過以上實驗結果,結合《酵母菌的特征和鑒定手冊》[13]可初步判斷9#菌為畢赤酵母屬。

表1 9#菌與乳酸菌的糖發酵與同化能力

2.3 分子生物學鑒定

26S rDNA的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。26S rDNA的D1/D2區域位于大亞基的5′端,序列長度在600 bp左右。目前大多數酵母菌模式菌株的26S rDNA已被測定并公布,所以26S rDNA 的D1/D2區域可作為酵母菌種級水平的鑒定依據[14]。

圖2 PCR產物電泳圖

在NCBI經Blast比對,9#菌與Meyerozymaguilliermondii相似性達到100%。利用MEGA5.0軟件構建系統發育樹,如圖3所示。

圖3 利用26S rDNA序列構建系統發育樹

結合其菌體的個體、群體形態特征,生理生化實驗結果及菌株的26S rDNA 分子測序結果,確定9#菌為季也蒙氏畢赤酵母(M.guilliermondii),命名為M.guilliermondiiJ616。

2.4 酵母菌與副干酪乳桿菌L1的共凝集特性

2.4.1 緩沖液對兩株菌共凝集能力的影響 由圖4可以看出,采用不同的緩沖液制成菌懸液后,在4 h時,蒸餾水組的共凝集率為42.5%,PBS組為41.3%,差異不顯著(p>0.05),24 h后,蒸餾水組達到68.8%,而PBS組為60.2%,共凝集率顯著升高(p<0.05),故無菌蒸餾水更適合做共凝集時的分散劑。造成這種結果的原因可能是PBS中的離子干擾了兩株菌表面共凝集因子互相結合。與PBS相比,蒸餾水對這種作用影響不大。

圖4 緩沖液對共凝集率的影響

2.4.2 孵育溫度對兩株菌共凝集能力的影響 由圖5可知,4 h時各實驗組共凝集率差異顯著(p<0.05),其中35 ℃組共凝集率最高,達到52.6%,20 ℃組共凝集率最低為43.1%;24 h時不同溫度條件下兩株菌的共凝集率差異顯著(p<0.05),35 ℃組共凝集率最高,達到72.7%,65 ℃組最低,共凝集率為58.4%。可以看出,與35 ℃組相比,高溫和低溫環境對共凝集均有抑制作用,這表明共凝集因子可能包含某種蛋白,環境溫度對其發揮作用有重要影響。

圖5 溫度對共凝集率的影響

2.4.3 pH對兩株菌共凝集能力的影響 由圖6可以看出,在不同pH下,共凝集率變化較差異顯著(p<0.05)。當pH為5.0時,無論是4 h組還是24 h組,其共凝集率都是最高的,分別為52.8%和70.4%,當pH為酸性(pH<7)時,其共凝集率高于堿性(pH>7)環境,這表明酸性環境可促進共凝集率升高。在張明[1]的研究中,副干酪乳桿菌L1在pH為5.0左右時對甘薯淀粉有較好的沉降效果,這進一步表明副干酪乳桿菌L1與淀粉絮凝的結合位點可能與酵母菌的共凝集因子有某種聯系,但其詳細的作用機理仍需深入研究。

圖6 pH對共凝集率的影響

2.4.4 超聲處理對兩株菌共凝集能力的影響 超聲處理的目的是將兩株菌的細胞在懸浮液打散,使其分布得更加均勻。由圖7可以看出,超聲處理后兩株菌共凝集率普遍提高,且4 h組和24 h組都差異顯著(p<0.05)，超聲處理條件下孵育時間24 h時，兩株菌共凝聚率為74.8%。這說明超聲處理后,兩種共凝集菌細胞可以充分接觸,使得共凝集更為強烈。

圖7 超聲處理對共凝集率的影響

2.4.5 生長期對兩株菌共凝集能力的影響 由圖8可以看出,不同生長期的酵母菌對共凝集率的影響4 h組和24 h組差異都不顯著(p<0.05)。不同生長期的酵母菌與副干酪乳桿菌L1共同孵育后,4 h后共凝集率穩定在47%左右,24 h后共凝集率穩定在70%左右。這說明不同時期的酵母菌并沒有影響共凝集的強度,這與王海超[15]的研究結果一致,表明了酵母菌在不同時期的代謝產物沒有參與到共凝集反應中,其參與共凝集反應的物質結構基礎不是隨菌體生長時期的變化而產生的,而是和菌體生長呈平行關系,遺傳穩定性大。

圖8 生長期對共凝集率的影響

3 結論

本研究在自然發酵的甘薯酸漿中,采用PDA固體培養基平板涂布法分離、純化,篩選出一株促進副干酪乳桿菌L1絮凝淀粉的酵母菌。經生理生化實驗和26S rDNA分子測序鑒定,確定該酵母菌為季也蒙氏畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii),并命名為M.guilliermondiiJ616。以副干酪乳桿菌L1與M.guilliermondiiJ616共凝集率為指標,確定了孵育前用無菌蒸餾水作緩沖液、超聲分散處理,孵育pH為5、溫度為35 ℃,這四種因素均可促進M.guilliermondiiJ616與副干酪乳桿菌L1共凝集。但不同生長期的酵母菌對共凝集沒有顯著影響。這為研究乳酸菌與酵母菌之間的相互作用關系提供理論依據,并為微生物絮凝劑的開發提供技術參考。