基于UPLC-Q-TOF-MS的植物乳桿菌 P-8發酵乳代謝物輪廓分析

王越男,米智慧,李常坤,潘 琳,孫志宏,孫天松

(內蒙古農業大學,乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,農業部奶制品加工重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018)

發酵乳是一種營養豐富、對人體健康有益的功能性乳制品,主要以新鮮的牛奶為原料,經過乳酸菌發酵制成[1-2]。目前,用于酸奶生產的乳酸菌主要有保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)[3-4]。長期食用發酵乳可有效抑制腸道內有害微生物、調節腸道菌群平衡、輔助降血壓、降低血清膽固醇水平、提高免疫力、抑制腫瘤和緩解乳糖不耐癥等[4-7]。

代謝組學(metabolomics或metabonomics)是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后興起的系統生物學的一個新分支,是通過考察生物體系受刺激或擾動后(如將某個特定的基因變異或環境變化后)其代謝產物的變化或其隨時間的變化,來研究生物體系代謝途徑的一種技術[8-10]。其已被廣泛應用于藥物科學[11-12]、食品科學和營養科學[13]等領域。目前代謝組學方法的分析技術主要有高分辨率質子核磁共振(NMR)譜、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)和氣相色譜-質譜(GC-MS)技術[14-15]等。而LC-MS和GC-MS代謝組學技術因具有高通量和高靈敏度的特性,已經廣泛用于乳制品中代謝物的定性和定量測定[15-17]。發酵乳是由幾百種生物分子組成的一個復雜的食品體系,主要包括蛋白質、脂類、碳水化合物和許多其他小分子化合物,如氨基酸、有機酸、核酸、脂肪酸、礦物質和風味物質,但是目前采用單一的分析平臺無法全面地測定出發酵乳中所有的代謝物[18]。應用代謝組學技術能夠監測不同發酵劑所發酵的制品在發酵和貯藏過程中代謝物的變化。Frank A. M. de Bok等[19]分析了不同混合發酵劑酸乳樣品的芳香物質代謝圖譜,研究發現很多來源于關鍵風味的質量峰在單個菌株或其制品中沒有,而在混合菌株的發酵產物中濃度較高,這種方法可以用來鑒定不同的風味物質是否來自不同的菌株或混合菌株,并作為其特有菌株的潛在生物標記物。

益生菌LactobacillusplantarumP-8(簡稱P-8)是2005年內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室從內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭的自然發酵酸牛乳中分離而來,具有調節血脂、抗氧化等益生作用[20]。2009年采用鳥槍法對L.plantrumP-8進行了全基因組序列分析和功能基因分析(CP005942)[21]。普通發酵乳所用菌種(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)對胃液的低pH和膽汁非常敏感,難以以活菌的形式到達腸道。而以乳桿菌屬和雙歧桿菌屬為主的益生菌則不同,能夠到達人體腸道并發揮調節微生態平衡,改善腸道菌群,降低膽固醇等作用。本實驗在商業發酵劑YC-X11中添加益生菌L.plantarumP-8混合發酵制備發酵乳,并采用超高效液相色譜和四級桿飛行時間串聯質譜技術(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)結合主成份分析(PCA)分析其達發酵終點(pH4.5)的代謝物圖譜,找出其主要差異代謝物,以探究其潛在的生物標記物,為功能性發酵乳的研發及其產業化提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.plantarumP-8 由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供;商業發酵劑YC-X11(含S.thermophilus和L.delbrueckiisubsp.Bulgaricus) 德國科漢森公司;脫脂乳粉 新西蘭恒天然有限公司;乙腈、甲酸 MS級,美國Fisher Scientific公司;氫氧化銨、亮氨酸腦啡肽 MS級,美國Sigma公司。

Acquity UPLC Xevo Q-TOF超高效液相-四級桿-飛行時間質譜儀(配備有在線脫氣系統、二元梯度高壓泵、自動進樣器和PDA檢測器) 美國Waters公司;Eppendorf真空濃縮儀、Eppendorf 5810 R臺式冷凍離心機 德國艾本德公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵乳的制備 還原牛乳(脫脂乳粉11%)經95 ℃、5 min巴氏殺菌后,冷卻至37 ℃,加入L.plantarumP-8和商業發酵劑YC-X11,于37 ℃恒溫培養,其中L.plantarumP-8接種量和商業發酵劑YC-X11添加量分別為1.0×107CFU/mL和0.003%,發酵至pH4.5終止。并將上述發酵乳-80 ℃保存,備用。

1.2.2 UPLC-Q-TOF MS代謝物圖譜分析

1.2.2.1 發酵乳樣品的預處理 將-80 ℃的發酵乳樣品置于室溫下解凍,解凍后經4500×g離心10 min,取上清液2 mL,加入乙腈溶液14 mL,漩渦振蕩2 min,經頻率40 kHz和功率300 W超聲提取5 min后12000×g高速離心15 min,取上清液置于真空濃縮儀,運行模式為水溶性溶劑、轉速為1400 r/min、功率為150 W的室溫條件下濃縮干燥,樣品干燥后加入500 μL 40%(v/v)的乙腈溶液復溶[22]。經0.22 μm微孔濾膜過濾后置于進樣瓶中,-20 ℃保存備用。

1.2.2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析 使用ACQUITY UPLC-Q-TOF-MS(Waters,USA)對所制備的發酵乳樣品進行代謝組學分析,采用ESI源正、負離子模式掃描(ESI+/ESI-)。采用反相系統對預處理好的樣品進行分離,色譜柱采用亞乙基橋雜化顆粒BEH C18(1.7 μm,2.1×100 mm)色譜柱進行分離,樣品進樣量為10 μL,流速0.45 mL/min,柱箱溫度35 ℃。正離子掃描模式下,流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液,負離子掃描模式下,流動相A為0.1%氨水溶液,流動相B為乙腈溶液,梯度洗脫程序按照正離子模式進行洗脫,梯度洗脫程序見表1。

表1 正、負離子模式下發酵乳UPLC-Q-TOF-MS流動相梯度洗脫條件

Q-TOF質譜儀采用ESI+和ESI-掃描模式,參數設置如下:毛細管電壓2.5 kV、錐孔電壓40 V、離子源溫度100 ℃、脫溶劑氣溫度350 ℃、脫溶劑氣流量600 L/h、錐孔氣流量50 L/h。質核比掃描范圍50～1000 m/z,為確保儀器的準確性,采用濃度為2 ng/mL亮氨酸腦啡肽(m/z=556.2771[M+H]+,m/z=554.2615[M-H]-)作為質量校正液,流速5 μL/min,Q-TOF MS數據采集模式為Centroid。

1.2.2.3 數據處理及代謝物的鑒定 UPLC-Q-TOF MS獲得的原始數據使用MassLynx與Progenesis QI軟件進行色譜峰提取,輸出矩陣數據集。并利用了Progenesis QI與Metaboanalyst軟件進行了差異性檢驗(t檢驗)與差異倍數檢驗(Fold Change)與變量投影重要性指標(VIP≥1)以確定組間顯著差異代謝物。

篩選出的顯著性代謝差異物根據其質荷比、保留時間(Retention time)和二級碎片信息通過Progenesis QI軟件在HMDB(http://www.hmdb.ca/),ECMDB(http://ecmdb.ca/),YMDB(http://www. ymdb.ca/)與KEGG(http://www.kegg.jp/),Chemspider(http://www.chemspider. com/)等數據庫進行檢索完確定其結構,其中理論質量數與實際測得的質量數的質量誤差閾值設置為10 ppm。篩選得到的差異代謝物進一步進行碎片信息的比對以及標準物質的比對。

2 結果與分析

2.1 發酵乳UPLC-Q-TOF色譜圖分析

本研究采用了UPLC-Q-TOF MS技術分析不同發酵乳達發酵終點時代謝物變化。圖1、圖2分別顯示脫脂乳、發酵乳在相同色譜和質譜ESI+和ESI-條件掃描模式下的基峰圖(Base peak intensity chromatograms,BPI chromato-grams)。

圖1 樣品BPI圖(正離子模式)

圖2 發酵乳BPI圖(負離子模式)

從圖1、2可知,在相同色譜條件下,樣品間色譜峰的數量和色譜峰離子強度存在一定的差異。

2.2 發酵乳的主成分分析結果

將脫脂乳和發酵乳樣品的原始數據導入MassLynx軟件(V4.1,Waters USA)軟件進行了PCA分析,結果見圖3。

圖3 正、負離子模式下發酵乳與脫脂乳的PCA得分圖

由PCA得分圖可見,復配發酵乳和脫脂乳兩組樣品組間能夠完全區分,正離子模式下主成分1和主成分2的貢獻率分別為62.2%和22.9%,負離子模式下主成分1和主成分2的貢獻率分別為61.7%和27.2%,對樣品的累計貢獻率均大于85%,具有較好的代表性。

2.3 發酵乳的代謝差異物鑒定和分析

本研究應用MassLynx軟件(V4.1,Waters USA)進行代謝物鑒定。在正離子和負離子模式下分別檢測到6096個和471個代謝物,根據VIP值≥1、差異倍數≥2和p<0.05的篩選原則,共鑒定得到152個差異代謝物(正離子87個和負離子65個)。隨后,通過相應的數據庫對其結構進行了鑒定,結果見表2。

由表2可知,發酵乳與脫脂乳兩組樣品中的差異代謝物主要為有機酸(16種)、多肽(20種)、游離氨基酸(12種)和核酸代謝物(8種)等。與脫脂乳相比,發酵乳中16種有機酸變化顯著,琥珀酸(succinic acid)、檸檬酸(citrate acid)和順烏頭酸(homo-cis-aconitate)都是三羧酸循環中的重要節點化合物。而葡糖胺-6-磷酸(glucosamine-6-phosphate)則在糖酵解中發揮重要作用,糖酵解作為乳酸菌的一種最重要的提供能量的方式,為乳酸菌的生長和繁殖提供大量能量。乙酰胞壁酸(Acetylmuramic acid)細菌是細胞壁的重要組成成分,在構建細胞壁中發揮著重要作用。這主要和發酵劑的糖酵解、檸檬酸循環和丙酮酸代謝等因素有關,這與以前的研究報道一致[23-26]。

表2 發酵乳與脫脂乳的差異代謝物

續表

續表

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發酵乳中共有12種游離氨基酸含量顯著增加,包括L-高絲氨酸(L-Homoserine)、L-半胱氨酸(L-Cysteine)、亮氨酸(L-Leucine)、鳥氨酸(Ornithine)、賴氨酸(L-Lysine)、精氨酸(Arginine)、瓜氨酸(Citrulline)、酪氨酸(Tyrosine)、纈氨酸(Valine)、蛋氨酸(L-methionine)和肌氨酸(Sarcosine),氨基酸不僅能給發酵乳帶來更多的營養物質,還可以作為發酵乳中發酵菌株的營養物質,促進菌株的生長繁殖,游離氨基酸越多越能更快地促進菌株生長繁殖。Khalid N M等[27]通過SDS-PAGE方法測定L.plantarum水解牛乳蛋白,發現L.plantarum主要降解牛乳中的β-酪蛋白,產生游離氨基酸和短肽。在本次研究中采用代謝組學技術所鑒定的亮氨酸、蛋氨酸和酪氨酸等氨基酸與其他發酵乳制品代謝產物的鑒定結果是一致的[28-29]。Pan等[30]采用代謝組學的分析方法研究了布里亞特傳統乳制品和商業乳制品的代謝產物,結果發現二者的主要差異代謝物為短肽和氨基酸。

與脫脂乳相比,發酵乳中有20種多肽類物質顯著變化,其中有6種多肽Thr-Val[31]、Asn-Pro[32]、Val-Asn[31]、Asn-Thr[31]、Asn-Leu[31]、Trp-Ala[31]和Try-Ser[33]屬于二肽基肽酶IV抑制劑,在體內最終能夠起到降低血糖的效果,具有拮抗2型糖尿病的潛力。另有相關研究報道,當肽類物質的肽鏈羧基端為色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸和異亮氨酸時,則具有良好的降血壓功能[34]。由此可說明差異代謝物中的2種多肽Trp-Ala[32]和His-Gly[35]具備ACE抑制活性,具有在體內降血壓的潛力。Leu-Val是一種在體內有葡萄糖攝取功能的刺激肽,可促進組織或器官對葡萄糖的吸收和利用[36]。

L.plantarumP-8和商業發酵劑復配發酵可產生大量風味物質,包括己酸(Hexanoic acid)、檸檬酸,琥珀酸(Succinic acid)、乙酸己酯(Hexyl acetate)、己醛(Hexanal)、丁酸丁酯(Butyl butyrate)、棕櫚酸(Palmitic acid)、月桂酸(Lauric acid)等。發酵乳中風味物質主要有羰基化合物、酸類化合物、醇類化合物和酯類化合物等。酯類化合物是發酵乳中的重要揮發性化合物,主要通過脂肪酸水解和微生物代謝產生,其中一些分子質量較低的酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯等)對發酵乳的風味影響較大。Imhof等[37]在發酵乳中發現微量的乙酸乙酯;而Guler等[38]在發酵乳貯藏30 d后檢測到乙酸乙酯,且隨著貯藏時間的延長,乙酸乙酯的濃度呈上升趨勢。大多數酯類化合物具有水果和花香味,能降低脂肪酸和胺帶來的苦味。乳酸菌發酵牛乳中的乳糖等碳水化合物生成乳酸和一些有機酸,如丙酮酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、草酸、琥珀酸等。這些有機酸是發酵乳中重要呈味物質,其相對含量較高,能賦予其獨特的口感和風味[4,39]。

作為發酵乳中增加的另外一種重要代謝物,γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyrate,GABA)的含量在發酵乳中顯著(348.63倍)高于脫脂乳。GABA是很多發酵食品中的重要功能成分之一。Tatsuro Hagi等[40]利用代謝組學的方法分析發酵乳制品的代謝產物,研究發現,與對照組牛乳相比較,發酵乳制品中GABA的含量顯著增加(1216倍),且富含GABA的發酵乳中,ACE抑制肽的含量較高。Lee等[41]研究集中益生菌在發酵過程中GABA含量的變化,發現L.plantarumK154的培養基中GABA的含量顯著高于其它菌株,并且在培養基中有大量的具有生物活性的多肽。本研究中,在商業發酵劑中添加一定數量的益生菌L.plantarumP-8進行發酵,GABA含量顯著增加，這一研究結果可能為其在神經系統障礙領域的開發提供依據。

L-肉毒堿在發酵乳中的含量顯著升高(p<0.05)。這與許多研究文獻中肉毒堿和脂質代謝密切相關[42-43]。它促進了長鏈脂肪酰輔酶A轉運細胞質進入線粒體。但是,到目前為止,L-肉毒堿在細菌內的代謝和功能仍不清楚。它可以作為細菌的滲透保護劑,如可以促進大腸桿菌生長[22]。Boucher等[1]采用UPLC-MS和GC-MS代謝組學的分析技術研究干酪的代謝圖譜,共鑒定45個代謝物,其中包括12種氨基酸、25種芳香物質、4種維生素、尿酸、肌酸和肉毒堿。可見代謝組學作為一種解決復雜機制中差異分析的技術方法,在食品領域受到越來越多研究者的青睞。

3 結論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS代謝組學技術結合PCA的分析方法對脫脂乳、L.plantarumP-8與商業發酵劑YC-X11發酵乳進行了代謝圖譜分析。結果表明,采用UPLC-Q-TOF-MS代謝組學技術在正離子和負離子模式下分別檢測到6096個和471個代謝物,根據篩選原則,共鑒定得到152個差異代謝物(正離子87個和負離子65個)。L.plantarumP-8和商業發酵劑混合發酵產生琥珀酸、檸檬酸、L-高絲氨酸、L-半胱氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、Thr-Val、Asn-Pro、Val-Asn、Asn-Thr、Asn-Leu、Trp-Ala、乙酸己酯、己醛、丁酸丁酯、L-肉毒堿和γ-氨基丁酸等有機酸、氨基酸、多肽和風味物質,為功能性乳制品的開發及應用提供了理論基礎和技術支撐。因此代謝組學技術是理想的鑒定和區分發酵乳制品中差異代謝物的有效手段。