復合菌發酵米粉的制作工藝優化及其香氣成分

席慧婷,江平嶼,陳星光,徐軍軍,黃贛輝,鄧丹雯,*

(1.南昌大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.江西汪氏蜜蜂園有限公司,江西南昌 330100)

米粉是我國南方地區十分流行的小吃,是江西人民最愛的食物之一[1]。發酵米粉質地柔韌、富有彈性、水煮不糊湯、干炒不易斷,配以各種小菜進行炒制或用湯料進行湯煮,細膩柔滑,深受廣大消費者的喜愛。

米粉分為發酵米粉和非發酵米粉,經發酵的米粉較非發酵米粉口感爽滑、勁道感十足[2],從而提高了米粉的食用品質。經植物乳桿菌發酵的米粉具有較小的蒸煮損失率和較大的復水率[3]。目前,針對乳酸菌和酵母菌復合發酵米粉的研究較少。陽盈盈[4]運用常用的篩選分離方法對自然發酵的發糕及其發酵米漿進行微生物分析,研究發現其中的優勢菌株為乳酸菌和酵母菌。對于發酵米粉的應用主要為自然發酵和菌種發酵,且國內外較少發現用乳酸菌和酵母菌復合發酵米粉并對其香氣進行研究的報道,而本文擬用胚芽乳桿菌和釀酒酵母菌對米粉進行復合發酵,期望得到風味極佳的發酵米粉。

不同制作工藝的發酵米粉會帶來不同的口感,大米浸泡發酵時間過短會導致發酵不完全,發酵時間過長會容易混入雜菌導致米粉變餿[5]。本文采用自然發酵米粉中的優勢菌株釀酒酵母菌和胚芽乳桿菌[6]作為發酵菌株,并探討復合菌株配比、發酵時間、發酵溫度、接漿量的參數,以彈性值和感官評價值為依據得到最佳的發酵米粉工藝,利用香氣成分對發酵米粉進行評價,為后續發酵米粉的研究提供一定的依據。

質構特性和香味物質是評價發酵米粉的重要指標,發酵米粉的香氣成分復雜、種類多樣,許多文章已有報道[7-10]。利用頂空微萃取技術與氣相色譜-質譜法聯用技術,檢測揮發性氣味具有便捷、經濟、靈敏度高等一系列優勢。本研究采用手動固相微萃取法和氣相色譜-質譜聯用技術對自然發酵米粉和復合菌發酵米粉的香氣物質進行提取和檢測分析,以期得到其最佳的乳酸菌和酵母菌的復配比例和呈現香氣的主要成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米 湖南省衡陽金優大米廠,粉碎過90目篩;菌種:釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、胚芽乳桿菌(Lacbobacillusplantarum) 保存于南昌大學食品學院食品科學與技術國家重點實驗室。

772N可見分光光度計 上海精科儀器有限公司;HSY2-SP電熱恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學儀器廠;SPX-250BSH-II生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;FA2004電子天平 舜宇恒平儀器;TGL-15B離心機 上海安亭科學儀器廠;Universal TA質構儀 上海騰拔儀器科技有限公司;Agilent7890氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司;DVB/CAR/PDMS50/30 μm手動固相微萃取進樣器 美國Agilent公司。

1.2 培養基的配制

黃豆芽汁培養基[11]:食用黃豆芽100 g、瓊脂20 g、葡萄糖50 g,在洗凈的黃豆芽中加入1000 mL蒸餾水,小火沸煮30 min,過濾,將水補足,加入葡萄糖,煮沸后加入瓊脂,繼續加熱融化,分裝包扎,在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min,備用。

MRS液體培養基[12]:牛肉蛋白粉15 g,醋酸鈉5 g,硫酸鎂0.58 g,檸檬酸二銨2 g,葡萄糖20 g,酵母菌浸出液4 g,硫酸錳0.28 g,吐溫80 0.1 mL,蒸餾水1000 mL,pH6.2,在121 ℃下高壓蒸汽滅菌備用。

1.3 胚芽乳桿菌和釀酒酵母菌培養條件的確定

1.3.1 胚芽乳桿菌培養條件優化 取10 mL預先配好的MRS液體培養基于錐形瓶中,并接種胚芽乳桿菌,分別在20、25、30、35、40 ℃條件下培養18 h,測OD值,確定最佳培養溫度。

取10 mL預先配好的MRS液體培養基于錐形瓶中,并接種胚芽乳桿菌,并在上述得到的最佳培養溫度下連續培養21 h,測OD值,每隔3.5 h測定一次,確定最佳培養時間。

1.3.2 釀酒酵母菌培養條件優化 取10 mL預先配好的豆芽汁培養基于錐形瓶中,并接種釀酒酵母菌,分別在20、25、30、35、40 ℃條件下培養20 h,測OD值,OD值與菌液中的微生物計數呈相關關系[13],可以通過測得的OD值來反應活菌數,確定最佳培養溫度。

取10 mL預先配好的豆芽汁培養基于錐形瓶中,并接種釀酒酵母菌,并在上述得到的最佳培養溫度下連續培養18 h,測OD值,每隔2 h測一次,確定最佳培養時間。

1.3.3 釀酒酵母菌與胚芽乳桿菌菌體的獲取 取配好的黃豆芽培養基20 mL加入到200 mL的錐形瓶中,接種釀酒酵母菌,然后放入生化培養箱中,在上述實驗獲得的最佳條件下進行培養,取出,將三角瓶轉移至無菌離心管中,4000 r/min離心30 min,使溶液分層,用生理鹽水將菌種清洗,可制備出所需的純釀酒酵母菌種。同上述方法,在MRS液體培養基中接種胚芽乳桿菌,進行培養、離心,制備所需的純胚芽乳桿菌菌種。

1.4 發酵米粉的制作

大米預處理→磨粉→浸泡→接菌發酵→氣蒸擠絲成型→老化→復蒸→洗粉切斷→殺菌→冷卻→計量包裝→預檢→復檢成品[14-15]

將大米進行磨粉并過90目篩得到大米粉,稱取10 kg制備的大米粉樣品,加水15 mL,將米漿在紫外燈下滅菌,接入釀酒酵母菌與胚芽乳桿菌按一定配比得到的復合菌種，按1%的接種量直接接種到50 g米漿中,靜置發酵30 min,得到發酵成熟米漿后,再次以一定的接漿量接入到無菌米漿中,在一定溫度下發酵一定時間,將發酵好的米漿進行氣蒸凝固,擠絲成型,再置于冷水中老化3 h,使米粉迅速成型以減少粘性,復蒸5 min使其更加有韌性,將復蒸好的米粉條直接放入水中進行清洗切條,用40 ℃熱風干燥使米粉含水量達到10%,用紫外燈進行滅菌,冷卻到室溫,用密封袋進行包裝,每袋250 g。以自然發酵米粉[16]所制得的米粉樣品作為對照,命名為樣品1,接種釀酒酵母菌與胚芽乳桿菌的復合菌發酵得到的米粉樣品為樣品2。

1.5 復合菌發酵米粉制作的工藝優化

1.5.1 單因素實驗

1.5.1.1 菌種的不同配比對發酵米粉彈性值的影響 將上述所制備的胚芽乳桿菌與釀酒酵母菌菌體分別以1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1的比例配比,接種復合菌進行發酵得到成熟米漿,再以10%的接漿量接種到新鮮米漿中,在30 ℃發酵12 h,氣蒸擠絲,確定胚芽乳桿菌與釀酒酵母菌的配比對發酵米粉質構的影響。

1.5.1.2 接漿量對發酵米粉彈性值的影響 將所制備的胚芽乳桿菌與釀酒酵母菌菌體分別以1∶1的比例配比,接種復合菌進行發酵得到成熟米漿,分別以5%、7.5%、10%、12.5%、15%、20%的接漿量接入新鮮米漿中進行發酵,在30 ℃發酵12 h,氣蒸擠絲,確定接漿量對發酵米粉質構的影響。

1.5.1.3 發酵溫度對發酵米粉彈性值的影響 將所制備的胚芽乳桿菌與釀酒酵母菌菌體分別以1∶1的比例配比,接種復合菌進行發酵得到成熟米漿,分別以10%的接漿量接入新鮮米漿中進行發酵,分別在20、25、30、35、40 ℃條件下發酵12 h,氣蒸擠絲,確定發酵溫度對發酵米粉質構的影響。

1.5.1.4 發酵時間對發酵米粉彈性值的影響 將所制備的胚芽乳桿菌與釀酒酵母菌菌體分別以1∶1的比例配比,接種復合菌進行發酵得到成熟米漿,分別以10%的接漿量接入新鮮米漿中進行發酵,分別在30 ℃條件下分別發酵4、8、12、16、20 h,氣蒸擠絲,確定發酵時間對發酵米粉質構的影響。

1.5.2 正交試驗 根據研究報道,設計正試實驗表[17]。設計四因素三水平的正交試驗,以菌種配比、接漿量、發酵溫度、發酵時間作為四因素其三水平,據此設計正交試驗,進行彈性值測定和感官評價。

表1 正交試驗因素及水平表

1.6 指標的測定

1.6.1 OD值的測定 OD值直接用分光光度計進行測定[18],測定波長為410 nm,并做三次平行試驗,取平均值。

1.6.2 彈性值的測定 取制作好的發酵米粉3根等間距放在P/36R探頭的測定臺上測定,質構儀測定參數設置:測定模式TPA;測定探頭P/36R;下行速度6 mm/s;測定速度2 mm/s;上行速度6 mm/s;應變位移60%;引發力5 g;引發類型,自動;獲取數率400PPS;記錄質構儀顯示的數據并分析圖譜[19]。

1.6.3 感官評價方法 采用農業行業標準NY/T 1512-2014感官評價法對自然發酵和復合菌發酵的米粉進行感官評價,感官評價小組由20人組成,包括5位老師和15位學生,參與人員都經過專業感官品嘗訓練。從組織形態、色澤、滋味氣味、雜質方面分別對發酵米粉進行感官評價,每項都有5個評分等級,根據評定成員對成品的喜愛程度分級,-2:極不喜歡;-1:輕度不喜歡;0:無所謂;1:輕度喜歡;2:極喜歡。

1.7 發酵米粉香氣成分分析

1.7.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)提取發酵米粉香氣成分 分別將5 g的發酵米粉樣品1、樣品2移入到頂空瓶中,蓋緊瓶蓋,在60 ℃下水浴,平衡15 min,之后使用DVB/CAR/PDMS三層復合萃取頭頂空吸附40 min,吸附時頂空瓶應一直處于水浴狀態,取下萃取頭,將水珠擦掉并接GC進樣口,解析5 min,并做3次平行試驗。

1.7.2 氣相色譜-質譜分析發酵米粉香氣成分 氣相色譜條件[20]:色譜柱為HP-5MS,30 m×0.25 mm×0.25 μm;載氣:氦氣;柱子流速:1 mL/min;進樣口溫度:250 ℃;萃取頭解析5 min,開始溫度50 ℃平衡4 min,之后以4 ℃/min的速率達到150 ℃,升溫10 ℃/min,終溫250 ℃,平衡10 min。

質譜條件:離子化方式:EI;電子能量:70 eV;質量范圍35～350 m/z,色譜-質譜接口溫度:250 ℃,離子源溫度:230 ℃;四級桿溫度:150 ℃。

1.7.3 定性定量方法 定性是對氣相色譜-質譜聯用儀的計算機NIST質譜庫進行檢索,選擇匹配度為85%以上的香氣成分。定量是根據總離子流圖由計算機采用峰面積歸一化法計算相對含量。

1.8 數據分析

實驗數據采用軟件SPSS 19.0進行方差分析,采用OriginPro 8.0進行作圖。

2 結果與討論

2.1 胚芽乳桿菌和釀酒酵母菌培養條件的確定

2.1.1 胚芽乳桿菌發酵溫度的優化 溫度對胚芽乳桿菌生長狀況的影響如圖1所示,胚芽乳桿菌在20～30 ℃時的繁殖狀況隨著培養溫度的升高而增大,當溫度達到30 ℃時,胚芽乳桿菌的生長達到最大值,并且在25～30 ℃時,繁殖較為迅速,當培養溫度繼續升至35 ℃時,胚芽乳桿菌的生長呈下降的趨勢。隨著溫度的升高,越來越適宜胚芽乳桿菌生長,因此生長繁殖速度也隨之增大,當達到最適溫度,繁殖速度也達到最大,溫度繼續升高,活動受到抑制,活菌數量也隨之減小。胚芽乳桿菌需要在最佳的培養溫度下生長,由本實驗可得最佳的培養溫度為30 ℃。根據研究報道,釀酒酵母菌的最佳培養溫度為35 ℃[21],跟本實驗較為相近。

圖1 培養溫度對胚芽乳桿菌生長的影響

2.1.2 胚芽乳桿菌發酵時間的優化 時間對胚芽乳桿菌生長繁殖的影響如圖2所示,當時間在7 h內,胚芽乳桿菌的繁殖狀況呈明顯的上升趨勢,在7～14 h內,繁殖速度增加,在14～17.5 h內繁殖速度達到最大;17.5 h之后,胚芽乳桿菌的繁殖狀況呈下降的趨勢。隨著時間的增加,培養基內的胚芽乳桿菌的活菌數增加,越來越適應該培養基環境條件,繁殖速度也隨著增大,當培養17.5 h時,活菌數基本達到穩定,代謝也達到最高峰,隨著培養時間的增加,有害代謝產物增加,抑制胚芽乳桿菌的生存,繁殖也開始減小。由此可知,胚芽乳桿菌的最佳培養時間為17.5 h。

圖2 培養時間對胚芽乳桿菌生長的影響

2.1.3 釀酒酵母菌培養溫度的優化 溫度對釀酒酵母菌生長繁殖的影響如圖3所示,釀酒酵母菌的繁殖在20～35 ℃之間隨著溫度的升高而增加,在20～25 ℃時,繁殖速度較為緩慢,25～35 ℃時,繁殖較為迅速;當溫度達到40 ℃時,培養一定的時間后有下降的趨勢。隨著溫度的升高,越來越適宜釀酒酵母菌的生長,繁殖速度也隨著增大,當達到最適宜溫度,活菌數也最多,隨著溫度的繼續升高,生長受到抑制,活菌數也隨之較少。酵母菌的生長繁殖需要合適的溫度,由此實驗可得酵母菌的最佳培養溫度為35 ℃。根據研究報道,釀酒酵母菌的最佳的培養溫度為30 ℃[22],跟本實驗較為相近。

圖3 培養溫度對釀酒酵母菌生長的影響

2.1.4 釀酒酵母菌培養時間的優化 時間對釀酒酵母菌生長繁殖的影響如圖4所示,在釀酒酵母菌生長12 h之內,其生長速度較快;當培養時間超過12 h，生長速率基本為零,逐漸達到穩定期,在12～14 h活菌數稍有減少,并未真正達到穩定,當培養時間達到16 h時,達到最大繁殖量,生長繁殖穩定,16 h之后,釀酒酵母菌繁殖速率為零。由此可得釀酒酵母菌的最佳培養時間為16 h。

圖4 培養時間對釀酒酵母菌生長的影響

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 菌種的不同配比對發酵米粉的影響 菌種的不同配比對發酵米粉質構特性的影響如圖5所示,當胚芽乳桿菌與釀酒酵母菌的配比在1∶4～1∶2時,其彈性值是增加的,當菌種的配比在1∶2～4∶1時,彈性值明顯減小,其中當菌種配比在1∶2～1∶1時,彈性值下降最為迅速,當釀酒酵母菌的比例大于胚芽乳桿菌時,所得到發酵米粉的彈性值較大,發酵可使淀粉結構發生變化[23],有利于淀粉的糊化,使得米粉的彈性增大,分析得釀酒酵母菌可能更利于淀粉的糊化,在最佳的菌種配比情況下,彈性才能達到最大值。由此可得,胚芽乳桿菌與釀酒酵母菌的最佳配比為1∶2。

圖5 菌種的不同配比對發酵米粉彈性值的影響

2.2.2 接漿量對發酵米粉的影響 接漿量對發酵米粉質構特性的影響如圖6所示,在接漿量為5%～10%時,米粉彈性值隨著接漿量的升高而增大,當接漿量在10%～20%時,米粉彈性值隨著接漿量的增大而減小,其中當接漿量為10%時,彈性值達到最大值,由此可得,發酵米粉工藝中的最佳接漿量為10%。

圖6 接漿量對發酵米粉彈性值的影響

2.2.3 發酵溫度對發酵米粉的影響 溫度對發酵米粉質構特性的影響如圖7所示,在溫度在20～35 ℃時,隨著溫度的升高,彈性值也隨之增大,當溫度為35 ℃時,米粉的彈性值達到最大,當溫度在35～40 ℃時,發酵米粉的彈性值開始下降,即在35 ℃時最適宜復合菌的發酵,在發酵過程中所產生的酶和酸使得米粉的性質發生一定的變化,促進米粉凝膠質構的形成[24]。發酵米粉需要在最佳的發酵溫度下進行發酵,可得最佳的發酵溫度為35 ℃。

圖7 溫度對發酵米粉彈性值的影響

2.2.4 發酵時間對發酵米粉的影響 時間對發酵米粉質構特性的影響如圖8所示,在發酵時間在4～16 h時,隨著發酵時間的增長,彈性值隨之增大,在發酵時間為16 h時,發酵米粉的彈性值達到最大值,在發酵時間在16～20 h時,發酵米粉的彈性值減小,在發酵過程中,米粉中的脂肪被分解為游離的脂肪酸,導致米粉中的脂肪含量降低[25],隨著發酵的時間增加,游離脂肪酸分解為低分子的醛、酮等物質,使米粉出現不良氣味[26],有害的代謝產物的增加,也會抑制菌種的生長,使得米粉的彈性值下降。得到發酵工藝的最佳發酵時間為16 h。

圖8 時間對發酵米粉彈性值的影響

2.3 復合發酵米粉制作的工藝優化

由表2可得,在四個影響因素中,對發酵米粉彈性值影響強弱為:菌株配比>發酵溫度>發酵時間>接漿量,對發酵米粉感官評價值影響程度為:菌株配比>發酵時間>發酵溫度>接漿量。經過數據分析可得彈性值的最佳組合為A1B2C1D2,感官評價的最佳組合為A1B3C1D2。A1C1D2相同;其中因子B接漿量對發酵米粉的彈性值和感官評價的影響均為最小,考慮到經濟問題，選擇接漿量相對較少的B2。因此,選擇A1B2C1D2作為最佳組合,即菌種配比為1∶1,發酵溫度為30 ℃,發酵時間為16 h,接漿量10%,在該最佳發酵工藝參數下其發酵米粉,其米粉彈性值可達到0.896,感官評分為1.198,均高于其他實驗組合。

表2 正交實驗結果與分析

對實驗數據進行F檢驗,F<1

2.4 發酵米粉香氣成分分析

由表3中數據可知,樣品1的香氣成分有10種,樣品2的香氣成分有高達18種,樣品1中烷類和醇類含量較高,樣品2中醇類和酯類含量較高,香氣值大于1的香氣成分為樣品香氣的主要成分,樣品1香氣成分大于1的有3種,分別為二十九烷(3.012%)、1,3,5,7-環辛四烯(2.891%)和苯乙醇(3.056%);樣品2香氣成分大于1的有6種,分別為1,1-二十二烷氧基十六烷(3.214%)、苯乙醇(20.365%)、乙酸乙酯(17.022%)、乙酸2-甲基丁酯(5.326%)、癸酸乙酯(3.025%)、壬酸乙酯(1.066%)。醇類物質是發酵食品中的一種重要的揮發性氣味,有呈香的作用[27],樣品13中的醇類物質只有一種為苯乙醇,樣品2中的醇類物質有四種,分別為1-戊醇、庚醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇,與自然發酵米粉香氣相比,復合菌發酵米粉香氣成分中醇類物質含量和種類都較多,苯乙醇具有清甜的香味,是兩個樣品共有的香氣成分,含量都較高,為主要的呈味物質,1-辛烯-3-醇具有干草香氣,常用于香料的配制,為復合菌發酵米粉增加了香氣。酯類物質是發酵米粉中種類最多的一類香氣物質,對復合菌發酵米粉的香氣有著重要影響,其中自然發酵米粉中未檢測出酯類物質的存在,乙酸乙酯具有甜味,過高的含量會有溶劑的氣味[28],是復合菌發酵米粉的主要香味物質,癸酸乙酯具有酒香氣味,常作為調相劑食用,酯類賦予復合菌發酵米粉更為豐富的香氣。由數據可知,通過復合酵母菌發酵的米粉風味更為豐富。

圖9 樣品1GC-MS圖

圖10 樣品2GC-MS圖

2.5 發酵米粉的感官

表4中,組織形態方面,自然發酵米粉呈現均勻、無雜質的狀態,復合菌發酵米粉更能呈現出均勻的質地;色澤方面,自然發酵米粉呈現乳白透明狀態,復合發酵米粉更能呈現通透的質地;滋味方面,自然發酵米粉呈現出彈性、米粉應有的滋味,復合發酵米粉的彈性口感更強;雜質方面,發酵米粉不應出現黑斑、霉點等雜質,自然發酵米粉和復合菌發酵米粉都能達到極少雜質的狀態。由數值可知,在組織形態、色澤、滋味氣味、雜質方面,復合發酵米粉的數值都高于自然發酵米粉,由綜合評價的數值可知,復合發酵米粉的分值較高,其中復合菌發酵米粉1最受大眾歡迎。

表4 發酵米粉感官評價

3 結論

本文通過OD值的測定來確定菌株的最佳生長條件,得到胚芽乳桿菌的最適生長條件為在30 ℃下培養17.5 h,釀酒酵母菌的最適生長條件為在溫度35 ℃下培養16 h。通過彈性值的測定來確定發酵米粉的最佳發酵條件,在胚芽乳桿菌與釀酒酵母菌的比例為1∶1、接漿量10%、溫度30 ℃發酵16 h,得到質構特性較好的發酵米粉,彈性值為0.902。采用手動固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用技術對自然發酵米粉和復合菌種發酵米粉進行香氣成分分析,發現傳統自然發酵的米粉的香氣成分為10種,主要的呈味物質有三種,為醇類和烷類,不含酯類物質;而通過復合菌種發酵的米粉香氣成分達18種,主要的呈味物質有六種,為酯類、醇類。與自然發酵米粉相比,復合發酵米粉的香氣物質含量更高,種類更多,賦予復合菌發酵米粉更豐富的香氣。感官評價中復合菌發酵米粉1分值最高,最受大眾歡迎。由此可知,通過復合酵母菌發酵的米粉較傳統發酵米粉有更為豐富的香氣,為后續研究符合菌株發酵米粉的香氣成分提供一定的實踐經驗。