裂葉蕁麻對糖尿病小鼠肝臟損傷的保護作用

楊文娟,程世蕊,馬養民,龔 頻,何亞娟,胡 媛,毛跟年

(1.陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021;2.陜西科技大學化學與化工學院,教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室,陜西西安 710021)

糖尿病是危害人體健康的非傳染性慢性疾病之一,持續高血糖狀態可造成肝臟損傷,據報道,糖尿病人群中肝病發病率約50%[10]。由于肝臟代償作用較強,早期糖尿病并發肝臟損傷不明顯,但其累積效應會導致肝功能喪失而危及生命[11-12]。現代醫學研究表明糖尿病性肝病病因與高糖誘導的氧化應激異常有關,引起機體特異性免疫反應,以致糖脂代謝紊亂、微血管病變及微循環障礙[13]。目前關于裂葉蕁麻對糖尿病引起肝臟損傷的保護作用未見報道。

本研究采用STZ誘導構建Ⅱ型糖尿病小鼠模型,從氧化應激角度探討裂葉蕁麻在糖尿病性肝損傷的保護作用,以期為裂葉蕁麻相關保健產品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級ICR小鼠 60只,雄性,體質量(20±2) g,由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供,動物生產許可證號SCXK(陜)2017-003,自由飲食飲水,12 h交替光照,SPF環境飼養;裂葉蕁麻藥材 采自陜西省旬陽縣,經陜西中醫藥大學顏永剛教授鑒定為蕁麻科裂葉蕁麻(UrticafissaE.Pritz.)的根莖;鏈脲佐菌素(STZ) 美國Sigma公司,溶解于0.1 mol/L(pH4.4)檸檬酸鹽緩沖液,臨用前配制;ACCU-CHEK活力型血糖試紙 羅氏診斷試劑公司;考馬斯亮藍G-250 瑞士阿達瑪斯公司;SOD、MDA、CAT試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

全活力血糖儀 德國羅氏公司;Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀 芬蘭THERMO;BSASS2S電子天平 德國賽多利斯科學儀器有限公司;PHS-3C精密PH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;WH3微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;DM2500/DFC正置式顯微鏡 德國Leica。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂葉蕁麻提取物的制備 取裂葉蕁麻根莖適量,粉碎,過40目篩,10倍量70%乙醇回流提取2 次,每次1 h,減壓濃縮,凍干(-50 ℃,6 h),臨用前配制1 g生藥/mL的溶液。

1.2.2 動物模型的建立及給藥 健康ICR小鼠60只,適應性飼養7 d,隨機取10只作為空白組,其余小鼠禁食12 h后,腹腔注射STZ溶液(75 mg/kg),連續注射2 d,1次/d,72 h后小鼠尾靜脈取血測空腹血糖,血糖值高于11.1 mmol/L即為造模成功。取造模成功的小鼠40 只隨機分為模型組、蕁麻低劑量組(100 mg/kg)、蕁麻中劑量組(200 mg/kg)、蕁麻高劑量組(400 mg/kg),每組10只;空白組和模型組給予生理鹽水,各藥物組按照相應劑量灌胃,給藥量均為0.1 mL/10 g,1次/d,連續給藥30 d。

1.2.3 體質量和肝臟指數的測定 小鼠體質量的測定:于實驗的第0、5、10、15、20、25、30 d測定小鼠體質量,并記錄。

肝臟指數的測定:末次給藥后小鼠脫頸椎處死,迅速取出肝臟,冷生理鹽水漂洗,稱濕重,計算肝臟指數。

肝臟指數(%)=(肝臟質量/體質量)×100

1.2.4 肝臟組織病理觀察 取相同部位肝臟組織,生理鹽水沖洗后用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片厚度5 μm,蘇木素-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡下進行組織病理觀察。

1.2.5 MDA、PCO含量及SOD、CAT活性的測定 取適量肝臟制備10%的肝組織勻漿,3000 r/min離心10 min,取上清,測定MDA、PCO含量及SOD、CAT活性,肝臟蛋白羰基化程度用2,4-二硝基苯肼法測定,其余指標測定的具體操作按照試劑盒方法進行。

1.3 統計學處理

采用Origin 8.5作圖,SPSS 19.0軟件進行統計學分析,組間比較采用ANOVA分析,p<0.05為差異具有統計學意義,p<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 裂葉蕁麻對糖尿病小鼠體質量和肝臟指數的影響

如圖1所示,給藥前各組小鼠體質量較為均一,空白組小鼠體質量增長趨勢符合小鼠生長規律,模型組小鼠由于STZ造成胰島細胞損傷,血糖升高,體質量增長明顯減緩,與糖尿病“三多一少”中體重減少的臨床癥狀相符;裂葉蕁麻各劑量組小鼠從給藥15 d起,體質量出現明顯增長趨勢,高劑量組小鼠給藥30 d時的體質量接近正常小鼠,表明裂葉蕁麻提取物可以一定程度緩解糖尿病引起的體重降低。

圖1 裂葉蕁麻對小鼠體質量的影響

由圖2可知,與空白組相比,模型組小鼠的肝臟指數增加(p<0.01),表明糖尿病小鼠肝臟可能出現嚴重損傷,引起肝臟質量增大;與模型組相比,裂葉蕁麻高、中劑量組小鼠肝臟指數顯著低于模型組(p<0.01,p<0.05),表明經裂葉蕁麻提取物處理后,糖尿病小鼠的肝臟損傷有一定程度改善。

圖2 裂葉蕁麻對小鼠肝臟指數的影響

2.2 裂葉蕁麻對糖尿病小鼠肝臟組織形態的影響

如圖3所示,空白組小鼠肝小葉結構正常,排列整齊,圍繞中央靜脈向四周放射狀排列,肝細胞多角形,無腫脹,細胞中間有圓形細胞核(★);模型組小鼠可見肝小葉界限不清,肝細胞排列紊亂,出現腫脹、氣泡樣病變(☆),細胞密度減低,形態不規則,有大量炎性細胞浸潤。蕁麻各劑量組治療后肝臟病變有不同程度減輕,細胞腫脹減輕(▲),高、中劑量組緩解作用較明顯。由此可知,裂葉蕁麻能夠緩解糖尿病小鼠肝臟形態病理損傷,具有一定程度保護作用。

圖3 裂葉蕁麻對糖尿病小鼠肝臟形態組織學改變的影響(HE,200×)

2.3 裂葉蕁麻對糖尿病小鼠肝臟氧化損傷指標的影響

如圖4所示,模型組糖尿病小鼠肝臟組織脂質過氧化物MDA增多,與空白組相比,有顯著性差異(p<0.05),經蕁麻提取物處理后,可以減少肝組織MDA的生成,高劑量組差異有顯著性(p<0.05),表明糖尿病可以誘發肝臟的脂質過氧化反應,而裂葉蕁麻可以抑制體內的脂質過氧化物的產生。

圖4 裂葉蕁麻對糖尿病小鼠肝臟脂質過氧化的影響

由圖5可知,糖尿病組小鼠PCO含量增加,與空白組相比,差異極顯著(p<0.01),表明糖尿病對肝臟蛋白質產生明顯損傷,而裂葉蕁麻各劑量組能夠降低體內PCO水平,高劑量組保護作用具有統計學意義(p<0.05)。結果表明,糖尿病可以加速肝臟蛋白質羰基化[14],而裂葉蕁麻可以減輕肝臟蛋白質氧化應激狀態。

圖5 裂葉蕁麻對糖尿病小鼠肝臟蛋白羰基化的影響

2.4 裂葉蕁麻對糖尿病小鼠肝臟抗氧化酶活性的影響

如圖6所示,與空白組相比,糖尿病組小鼠SOD活力降低,差異極顯著(p<0.01),裂葉蕁麻各劑量組能夠恢復酶的活性,提高SOD水平,高、中劑量組保護作用顯著(p<0.01,p<0.05),表明糖尿病顯著抑制了肝臟超氧化物歧化酶的活性,而裂葉蕁麻可以減輕肝臟氧化應激狀態。

圖6 裂葉蕁麻對糖尿病小鼠肝臟超氧化物歧化酶的影響

由圖7可知,模型組糖尿病小鼠肝臟CAT活性明顯降低,與空白組相比,差異極顯著(p<0.01),而裂葉蕁麻各劑量組可以延緩肝臟組織CAT活力的降低,各劑量組均有顯著性差異(p<0.01,p<0.05),表明糖尿病降低了肝臟過氧化氫酶的活性,裂葉蕁麻可以一定程度恢復酶的活性,緩解CAT的降低。

圖7 裂葉蕁麻對糖尿病小鼠肝臟過氧化氫酶活性的影響

3 討論與結論

糖尿病長期高血糖狀態可造成代謝紊亂,誘發肝臟、心臟、腎臟等重要臟器損傷,導致許多并發癥的出現[15]。其中肝病在糖尿病中發病率較高,高血糖介導的氧化應激在糖尿病性肝臟損傷的發生發展中起著重要作用,由于血糖累積,肝臟代償有限,最終可發展為非酒精性肝病、肝纖維化、肝硬化等,嚴重危及生命[16-18]。研究表明蕁麻中黃酮類、多酚、鞣質等成分能夠調節小鼠體內SOD、CAT、GSH活性,減少MDA、PCO水平,也具有較強的體外清除自由基能力[19]。本研究通過建立STZ誘導Ⅱ型糖尿病小鼠模型,STZ損傷小鼠胰島β細胞,使胰島素分泌不足造成糖尿病。糖尿病典型癥狀為“三多一少”,即飲食飲水尿量增多、體重減少,裂葉蕁麻提取物能夠緩解糖尿病引起的體重減輕,控制糖尿病小鼠體重,并且減輕了肝臟損傷,降低了肝臟指數;糖脂代謝紊亂可導致肝臟組織形態學改變,肝細胞受損,本研究通過HE染色觀察肝臟組織基本形態,糖尿病小鼠肝臟細胞排列紊亂,腫脹明顯,細胞密度減低,裂葉蕁麻高、中劑量組對上述組織病理形態均有所改善,高劑量組改善作用明顯。因此,從上述生理指標及組織形態學反映出裂葉蕁麻具有對糖尿病小鼠肝臟損傷的保護作用。

MDA是細胞膜脂質過氧化產物之一,其可進一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質交聯,使細胞脆性增加和變形性降低,從而導致生物膜結構和功能的改變[20],PCO是蛋白質分子被自由基氧化修飾的一個重要標志物,它產生于活性氧攻擊氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基后最終生成的NH3和相應的羰基衍生物,因此,測定MDA和PCO含量能間接反映氧化應激狀態下機體受損傷的程度。實驗結果顯示,裂葉蕁麻減少了MDA、PCO含量,具有降低糖尿病小鼠肝臟氧化應激損傷的作用。

SOD和CAT是體內重要的抗氧化酶,是調節機體自由基及活性氧生成的重要因素,而糖尿病代謝紊亂狀態導致抗氧化酶活性被破壞[21-23],糖尿病小鼠的SOD和CAT活性顯著降低,裂葉蕁麻提取物可能通過對體內自由基的清除作用,減少氧化物的生成,進而提高肝臟中SOD和CAT活性,這可能是其保護糖尿病小鼠肝臟損傷的作用機制之一。

綜上所述,本實驗研究了裂葉蕁麻提取物在不同劑量下對肝臟氧化損傷指標及抗氧化酶活性的影響,證明了裂葉蕁麻能夠顯著改善糖尿病小鼠肝臟損傷狀態,減輕肝臟病理形態,對肝臟氧化損傷具有明確的緩解作用,這一結論為裂葉蕁麻在糖尿病人群的保健食品開發領域提供了新的方向和思路,但有待進一步研究,以期探討具體物質基礎及作用機制。