枳菊解郁湯對(duì)小鼠抑郁樣行為的改善作用及其機(jī)制

張璐瑤　鮑藝今　李文璇　范明才 張津銘　李亞

【摘 要】目的：研究枳菊解郁湯對(duì)慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（CUMS）小鼠抑郁樣行為的作用及其機(jī)制。方法：采用CUMS方式28天建立抑郁小鼠模型，灌胃枳菊解郁湯，通過開場(chǎng)、懸尾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠抑郁樣行為變化;并且檢測(cè)小鼠前腦皮層海馬血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組小鼠的水平活動(dòng)度和自發(fā)活動(dòng)明顯減弱，總僵住不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng);小鼠海馬及前腦皮層VEGF表達(dá)水平明顯降低;枳菊解郁湯連續(xù)灌胃28后，各劑量組和氟西汀組小鼠比模型組各檢測(cè)指標(biāo)均得到明顯逆轉(zhuǎn)。枳菊解郁湯中劑量組效果顯著。結(jié)論：中藥枳菊解郁湯可通過調(diào)控VEGF水平改善CUMS小鼠的抑郁樣行為。

【關(guān)鍵詞】枳菊解郁湯;慢性不可預(yù)見性應(yīng)激;抑郁樣行為;VEGF

中圖分類號(hào)：Q427 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2019）13-0079-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.13.036

Improvement and its Mechanism of Chinese Medicine Zhijujieyu-tang on Depression-like Behavior in Mice

ZHANG Lu-yao BAO Yi-jin LI Wen-xuan FAN Ming-cai ZHANG Jin-ming LI Ya

（School of Life Sciences，Qufu normal University，Shandong Qufu 273165，China）

【Abstract】Objective： To investigate the improvement and its mechanism of Zhijujieyu-tang on depression-like behaviors of chronic unpredictable mild stress （CUMS） mice，.Methods： The depression-like mice model was established by CUMS for 28 d.Zhijujieyu-tang and fluoxetine were intragastrically given to the mice.The depression-like behaviors were tested using the open field and tail suspension test. The changes of the Vascular endothelial growth factor （VEGF） in the hippocampus （HP） and prefrontal cortex （PFC） were evaluated by immunohistochemistry. Results： Compared with the control group， the exploration and spontaneous activity were significantly reduced， the immobility time were significantly increased， and the levels of VEGF contents in HP and PFC were apparently decreased in model group.After the mice were treated with fluoxetine and Zhijujieyu-tang， all the above indicators were significantly reversed. Zhijujieyu-tang medium dose group mice showed that it significantly effective. Conclusions： Zhijujieyu-tang improves behaviors of depressed model mice by modulating VEGF in HP and PFC.

【Key words】 Zhijujieyu-tang; CUMS; Depression-like behaviors; VEGF

研究表明，抑郁癥患者表現(xiàn)出情緒低落、行為絕望和認(rèn)知功能障礙等主要癥狀，嚴(yán)重威脅著人類的健康。枳菊解郁湯是本課題組經(jīng)單味藥精選、藥效篩選等得到的中藥復(fù)方，前期初步的研究結(jié)果表明，復(fù)方枳菊解郁湯具有一定的抗抑郁作用[1]，但其進(jìn)一步的效果以及作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管活性因子家族中的一員，能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有豐富的表達(dá)[2]，可以作為腦組織中的一種神經(jīng)因子，營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)神經(jīng)元，并且能夠抑制細(xì)胞凋亡[3]。抗抑郁藥物能夠促使VEGF的表達(dá)， VEGF與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，可以成為抑郁癥的生物學(xué)標(biāo)志[4]。本研究中，我們?cè)谝酝芯康幕A(chǔ)上，采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）制備抑郁模型小鼠，灌胃不同劑量的枳菊解郁湯，檢測(cè)小鼠前腦皮層海馬VEGF的表達(dá)。以探討枳菊解郁對(duì)小鼠抑郁樣行為的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

昆明品系小白鼠，2月齡，SPF級(jí)，雌雄各半，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）20140007。動(dòng)物自由進(jìn)食，飲水，在自然光暗周期動(dòng)物環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和使用方法

中藥復(fù)方枳菊解郁湯：枳實(shí)10g、石菖蒲15g、夜交藤20g、膽星10g、郁金15g、炒棗仁30g、勾藤30g、菊花15g、柏仁30g。依據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室先前的研究進(jìn)行[5]，按人鼠等效劑量換算（生藥量175g），每日在應(yīng)激前1小時(shí)給相應(yīng)小組灌胃，每只小鼠0.2 ml。鹽酸氟西?。喊凑杖耸蟮刃┝繐Q算，3.6mg/kg.d，灌胃，每只小鼠0.2ml[5]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組和CUMS模型小鼠的建立

隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照組，模型組，西藥陽性對(duì)照組（氟西汀 3.6mg/kg.d）、枳菊解郁湯高劑量（四倍濃度）組，中劑量（二倍濃度）組，低劑量（等量濃度）組，每組10只。CUMS方式包括7種不重復(fù)的方式應(yīng)激，包括：斜籠（24h），電擊足底，：在實(shí)驗(yàn)箱中，每天電刺激15次，每一次10秒，刺激電壓36V;通宵照明（產(chǎn)生明暗的顛倒），冷水刺激（8℃冷水，共計(jì)3min），禁食（24h），高臺(tái)：將小鼠放置在鐵架臺(tái)上高160cm，每天1h;禁水（24h）。依據(jù)我們先前的研究工作進(jìn)行[5]。每天隨機(jī)一種，使應(yīng)激具有不可預(yù)見性，共持續(xù)28天。

1.3.2 開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open-field test）

開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱是底部5×5=25cm個(gè)正方形格子，將小鼠置于開場(chǎng)中央?yún)^(qū)，開始計(jì)時(shí)5min，觀察小鼠的水平活動(dòng)、垂直活動(dòng)等，在周邊格走動(dòng)和中央格走動(dòng)的狀態(tài)時(shí)間等。記錄直立次數(shù)（兩前爪抬起來遠(yuǎn)離地面的次數(shù)）、穿越格數(shù)（四個(gè)爪完全進(jìn)入下一個(gè)格內(nèi)，為跨越一個(gè)水平格）、中央格停留時(shí)間。

1.3.3 懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test）

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠尾端2cm處固定在試管夾上，小鼠頭頂部距離箱子底部10cm，開始計(jì)時(shí)6min，需要記錄的指標(biāo)為：第一次靜止不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)潛伏期）：從開始懸掛計(jì)時(shí)至小鼠靜止不動(dòng);后4min小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

1.3.4 小鼠各腦區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化及 VEGF的表達(dá)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后，0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，灌流取腦，經(jīng)過常規(guī)的后固定，按通用的程序進(jìn)行，最后做冠狀切片（片厚5μm）。用于免疫組織化學(xué)（SABC法）染色。VEGF免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。取已制備完成的小鼠海馬各區(qū)及PFC切片，通過Olympus BX-51顯微鏡，在放大倍數(shù)為400倍的視野內(nèi)，進(jìn)行顯微拍照保存;利用圖像分析計(jì)算小鼠海馬和PFC的VEGF平均目標(biāo)灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SE）。開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和VEGF表達(dá)水平采用兩因素方差分析（two-way ANOVA），并以Bonferroni進(jìn)行多重差異比較，及非配對(duì)t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異用P<0.05來表示。

2 結(jié)果

2.1 開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組小鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表1）：相比于對(duì)照組，模型組小鼠的直立次數(shù)、穿越格數(shù)顯著減少（P<0.01，P<0.01），中央格停留時(shí)間顯著增多（P<0.01），表明在經(jīng)過了28天的CUMS處理以后，模型組小鼠在新環(huán)境下的探究行為、自發(fā)活動(dòng)明顯減少。相比于模型組，使用西藥氟西汀，及中藥灌胃28天以后，枳菊解郁湯各劑量組的開場(chǎng)行為指標(biāo)均有顯著變化。

2.2 懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表2）：相比于對(duì)照組小鼠，模型組小鼠的不動(dòng)潛伏期顯著減少（P<0.01），而后4min累計(jì)不動(dòng)時(shí)間顯著增加（P<0.01）;相比于模型組小鼠，中藥中劑量灌胃28天以后，小鼠的不動(dòng)潛伏期顯著增加（P<0.05，P<0.01）;其他各劑量組小鼠也增多，但無顯著性差異;后4min累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，氟西汀組、枳菊解郁湯中劑量組小鼠均顯著減少（P<0.01，P<0.01），顯示出明顯的抗抑郁作用。

2.3 各組小鼠各腦區(qū)VEGF的表達(dá)

模型組小鼠VEGF陽性細(xì)胞平均目標(biāo)灰度值在海馬和PFC 明顯增加（表3）（P<0.01，P<0.05）。相比于模型組小鼠，氟西汀、中藥中劑量灌胃28天以后，氟西汀組和中劑量組小鼠VEGF目標(biāo)灰度值明顯降低（P<0.01，P<0.05）;表明氟西汀組和中劑量組小鼠VEGF在海馬和PFC的表達(dá)增強(qiáng)。

3 討論

VEGF家族有7個(gè)成員，是血管形成重要的調(diào)控因子，主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞，但對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育也是必不可少的。在腦內(nèi)海馬齒狀回有高表達(dá)，可能直接促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞的增殖。在對(duì)新型抗抑郁藥物的研發(fā)及探索其作用機(jī)理的研究中，發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥物可增加海馬的VEGF 水平和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提示抗抑郁藥物在海馬的作用途徑;如果使用特異性的抑制劑阻斷VEGF的水平，可以發(fā)現(xiàn)海馬的神經(jīng)發(fā)生消失，抗抑郁作用也減弱[8]。

在本實(shí)驗(yàn)中，CUMS應(yīng)激方式建立小鼠抑郁動(dòng)物模型。結(jié)果顯示建模較成功，而中藥枳菊解郁湯能明顯增加小鼠對(duì)新異環(huán)境的活動(dòng)度，可改善抑郁模型小鼠的絕望情緒增加，起到一定的抗抑郁效果，且枳菊解郁湯中劑量組效果更明顯。本研究結(jié)果表明，連續(xù)給藥枳菊解郁湯處理28天，表現(xiàn)出明顯提高VEGF的表達(dá)水平，以減弱腦內(nèi)海馬和前腦皮層神經(jīng)元的功能減退。因此，可以推測(cè)CUMS導(dǎo)致的抑郁樣行為可能與前腦皮層和海馬VEGF表達(dá)降低密切相關(guān)，而中藥枳菊解郁湯可通過調(diào)控VEGF水平改善小鼠的抑郁樣行為。

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