嗎啡通過WNT/ β-catenin信號通路調控結腸癌細胞增殖和凋亡的分子機制研究

陳李駿，俞繼衛，張靈犀#

1上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院北院麻醉科，上海201999

2上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院普外科，上海2019990

結腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，近年來流行病學調查結果顯示，結腸癌的發病率呈逐年增高趨勢[1]。由于結腸癌的早期癥狀不明顯，多數患者確診時已處于中晚期。隨著免疫治療、基因治療等綜合治療模式的實施，一定程度上降低了結腸癌患者的病死率。嗎啡是臨床常用的一種緩解晚期腫瘤患者癌痛的藥物，相關研究發現，嗎啡能夠延長腫瘤患者的生存時間，并且其在多種腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡過程中發揮重要作用[2-3]，因此受到國內外研究者的廣泛關注。Qin等[4]研究顯示，外源性嗎啡通過細胞周期阻滯和凋亡誘導抑制人胃癌MGC-803細胞生長。而且，嗎啡還能夠抑制人卵巢癌SKOV3細胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導SKOV3細胞凋亡[5]。目前，關于嗎啡對結腸癌患者的影響多集中在免疫功能的研究[6]，關于嗎啡是否影響結腸癌細胞的生物學特性的研究尚未見報道。WNT/β-連環蛋白（βcatenin）信號通路在進化上高度保守，可以參與機體的生長、發育、組織再生、腫瘤和疾病的發生等多種生理病理過程[7]。已有研究顯示，WNT/βcatenin信號通路在結腸癌組織中異常激活，可參與結腸癌的發生、發展[8-9]。在大鼠海馬神經元慢性嗎啡成癮模型中，WNT/β-catenin信號通路過度激活[10]，提示嗎啡與WNT/β-catenin信號通路的激活有關。本研究探討嗎啡對人結腸癌LoVo細胞增殖和凋亡的影響，并對其可能的分子機制進行探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞株LoVo購自中國科學院上海生命科學學院細胞庫；嗎啡注射液購自東北制藥集團股份有限公司；F12K培養基、胎牛血清、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑均購自美國Sigma公司；胰蛋白酶購自杭州四季青生物工程材料有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的膜聯蛋白V（annexin V）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Abcam公司；電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）檢測試劑購自美國Thermo Fisher公司；β-catenin抗體、c-myc抗體、B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白（B-cell lymphoma/leukemia 2 associated X protein，BAX）抗體、cleaved caspase 3抗體以及二抗均購自美國CST公司；WNT/β-catenin信號通路活化劑氯化鋰（lithium chloride，LiCl）購自美國MP公司。

1.2 細胞培養和分組

將人結腸癌LoVo細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 U/L鏈霉素的F12K培養基中，置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養箱內培養，根據細胞的生長狀態及時更換新鮮培養基，待細胞貼壁生長達80%以上時，采用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取處于對數生長期的LoVo細胞進行分組處理：將采用終濃度為100 μmol/L的嗎啡處理的LoVo細胞記為MorL組；將采用終濃度為500 μmol/L的嗎啡處理的LoVo細胞記為MorH組；將采用等量F12K培養基培養的，不用嗎啡處理的LoVo細胞記為Control組。嗎啡終濃度的設置依據預實驗中嗎啡對結腸癌細胞干預48 h時的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。3組細胞處理后均置于37℃培養箱中繼續培養48 h，收集細胞進行后續指標檢測。

1.3 MTT法檢測LoVo細胞的增殖能力

取MorL組、MorH組和Control組處于對數生長期的LoVo細胞，以1×104/孔接種到96孔板中，培養48 h時分別在每孔細胞中加入150 μl MTT試劑，繼續孵育4 h，除去上清液，每孔細胞中加入100 μl二甲基亞砜，待沉淀完全溶解后，使用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度（A）值。計算3組Lo-Vo細胞的增殖率，細胞增殖率=實驗組A值/Control組A值×100%。

1.4 流式細胞儀檢測LoVo細胞凋亡情況

取MorL組、MorH組和Control組處于對數生長期的LoVo細胞，采用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞3次，隨后用結合緩沖液Bing buffer重懸細胞，調整細胞濃度為5×105/ml，分別在細胞中添加FITC-Annexin V和PI各5 μl，室溫下避光孵育20 min，立即上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 蛋白質印跡法（Westernblot）檢測LoVo細胞中蛋白表達水平

取MorL組、MorH組和Control組處于對數生長期的LoVo細胞，分別添加適量蛋白裂解液，置冰上提取細胞中總蛋白。以BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，以上樣緩沖液與蛋白混合，于沸水中加熱10 min致蛋白變性。取等量蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后將蛋白電轉至PVDF膜上，將膜置于脫脂奶粉封閉液中，封閉1 h，分別加入一抗雜交，其中βcatenin一抗1∶500稀釋，c-myc一抗1∶500稀釋，BAX一抗1∶800稀釋，cleaved caspase 3一抗1∶800稀釋，4℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution toween，PBST）洗膜3次后，再加入1∶2000稀釋的二抗，室溫雜交2 h。PBST洗膜3次后，以ECL法顯影，在凝膠成像系統中曝光、拍照，采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內參，計算目的蛋白的表達水平。

1.6 WNT/ β-catenin信號通路活化劑LiCl對嗎啡干預的LoVo細胞增殖、凋亡的影響

以20 mmol/L的LiCl處理100 μmol/L嗎啡誘導的人結腸癌LoVo細胞 48 h，記為MorL+LiCl組。取MorL+LiCl組和MorL組人結腸癌LoVo細胞，采用MTT法檢測細胞的增殖能力，方法同1.3；采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況，方法同1.4；采用Western blot檢測細胞中WNT/β-catenin信號通路相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達情況，方法同1.5。

1.7 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 嗎啡對人結腸癌LoVo細胞增殖能力的影響

不同濃度（0、100、500 μmol/L）嗎啡處理人結腸癌LoVo細胞48 h后，MTT法檢測結果顯示：MorL組和MorH組LoVo細胞的增殖率分別為（78.27±5.06）%、（65.09±4.13）%，均低于 Control組的（99.85±6.36）%，差異均有統計學意義（t=6.563、7.525，P＜0.05）；MorH組細胞的增殖率低于MorL組，差異有統計學意義（t=4.754，P＜0.05）。

2.2 嗎啡對人結腸癌LoVo細胞凋亡情況的影響

不同濃度（0、100、500 μmol/L）嗎啡處理人結腸癌LoVo細胞48 h后，流式細胞儀檢測結果顯示：Control組、MorL組和MorH組LoVo細胞的凋亡率分別為（3.08±0.42）%、（19.84±2.11）%、（28.69±3.06）%。MorL組和MorH組LoVo細胞的凋亡率均高于Control組，差異均有統計學意義（t=10.532、14.032，P＜0.05）；MorH組LoVo細胞的凋亡率高于MorL組，差異有統計學意義（t=6.854，P＜0.05）。（圖1）

圖1 流式細胞儀檢測不同組別LoVo細胞的凋亡情況

2.3 嗎啡對人結腸癌LoVo細胞WNT/ β-catenin信號通路相關蛋白及凋亡相關蛋白表達情況的影響

不同濃度（0、100、500 μmol/L）嗎啡處理人結腸癌LoVo細胞48 h后，Western blot檢測結果顯示 ：3組 LoVo細 胞 中 β-catenin、c-myc、BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=9.475、8.976、9.018、13.532，P＜0.01）。MorL組和MorH組LoVo細胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對表達量均低于Control組，BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對表達量均高于Control組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。MorH組Lo-Vo細胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對表達量均低于MorL組，BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對表達量均高于MorL組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1、圖2）

表1 3組LoVo細胞中WNT/ β-catenin信號通路相關蛋白及凋亡相關蛋白表達水平的比較（x± s）

圖1 Western blot檢測 3組LoVo細胞中WNT/ β-catenin信號通路相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達情況

2.4 LiCl對嗎啡誘導的人結腸癌LoVo細胞增殖和凋亡情況的影響

MTT法和流式細胞儀檢測結果顯示：MorL+LiCl組LoVo細胞的增殖率為（97.23±6.18）%，明顯高于MorL組的（78.68±5.29）%，差異有統計學意義（t=4.523，P＜0.01）；MorL+LiCl組LoVo細胞的凋亡率為（7.22±1.31）%，明顯低于MorL組的（19.47±2.64）%，差異有統計學意義（t=10.575，P＜0.01）。

2.5 LiCl對人結腸癌LoVo細胞WNT/ β-catenin信號通路相關蛋白及凋亡相關蛋白表達情況的影響

采用20 mmol/L LiCl處理嗎啡干預的LoVo細胞，Western blot檢測結果顯示：MorL+LiCl組LoVo細胞中BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對表達量均明顯低于MorL組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；MorL+LiCl組LoVo細胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對表達量均明顯高于MorL組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2、圖3）

表2 兩組LoVo細胞中WNT/ β-catenin信號通路相關蛋白及凋亡相關蛋白表達水平的比較（±s）

表2 兩組LoVo細胞中WNT/ β-catenin信號通路相關蛋白及凋亡相關蛋白表達水平的比較（±s）

組別MorL組MorL+LiCl組t值P值β-catenin 0.51±0.05 0.98±0.10 4.255＜0.01 c-myc 0.30±0.03 0.67±0.07 4.865＜0.01 BAX 0.24±0.03 0.09±0.01 7.853＜0.01 cleaved caspase 3 0.54±0.06 0.14±0.02 12.346＜0.01

圖3 Western blot檢測LiCl處理的經嗎啡誘導的人結腸癌LoVo細胞中WNT/ β-catenin信號通路相關蛋白和凋亡相關蛋白的表達情況

3 討論

嗎啡是臨床常用于緩解晚期腫瘤患者癌痛的麻醉性鎮痛藥物，相關研究發現，嗎啡對腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為具有一定的影響[11]。本研究結果顯示，MorL組和MorH組LoVo細胞的增殖率均低于Control組，且MorH組細胞的增殖率低于MorL組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。表明嗎啡對人結腸癌LoVo細胞的增殖具有抑制作用，且濃度越高抑制作用越強。此外，嗎啡還能夠誘導LoVo細胞凋亡。Kim等[12]研究發現，嗎啡通過與阿片生長因子受體相互作用可以抑制肺癌細胞的增殖。Ma等[13]研究顯示，嗎啡通過survivin依賴性信號轉導通路在體外可以促進人透明細胞腎細胞癌786-O細胞和RLC-310細胞的生長和侵襲。Chen等[14]的研究顯示，嗎啡能夠通過阻滯細胞周期，進而誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，MorL組和MorH組LoVo細胞的凋亡率均高于Control組，MorH組LoVo細胞的凋亡率高于MorL組（P＜0.05），與上述研究嗎啡能夠抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的研究相類似，說明嗎啡對于人結腸癌細胞的增殖也具有一定的抑制作用。并且進一步的研究也顯示，MorL組和MorH組LoVo細胞中BAX和cleaved caspase 3蛋白的相對表達量均高于Control組，且MorH組LoVo細胞中BAX和cleaved caspase 3蛋白的相對表達量均高于MorL組（P＜0.05）。BAX是Bcl-2基因家族中促進細胞凋亡的基因，其過度表達能夠使細胞趨向凋亡。caspase 3是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶之一，是細胞凋亡過程的執行者，caspase 3激活形式cleaved caspase 3的大量形成促使細胞發生凋亡。南振華和潘靈輝[15]的研究結果顯示，嗎啡通過促進caspase 3的表達抑制人結腸癌Ec109細胞生長，誘導細胞凋亡，與本研究結果相似。這進一步說明了嗎啡抗結腸癌的作用。

WNT/β-catenin通路被激活后，可以影響腫瘤相關基因的表達，從而引起結腸癌的發生和發展[16]。相關研究表明，WNT/β-catenin信號通路的激活能夠引起β-catenin轉位至細胞核，激活下游靶基因如c-myc、cyclin D1等，從而參與結腸癌的發生、發展[17]。多項研究表明，抑制WNT/β-catenin信號通路能夠抑制結腸癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡[18-19]。本研究結果顯示，MorL組和MorH組LoVo細胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對表達量均低于Control組，且MorH組LoVo細胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對表達量均低于MorL組（P＜0.05），說明嗎啡通過抑制WNT/β-catenin信號通路的激活抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。為進一步驗證該結論，本研究使用LiCl激活WNT/β-catenin信號通路，結果發現，MorL+LiCl組LoVo細胞的增殖率明顯高于MorL組，凋亡率明顯低于MorL組，BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對表達量均明顯低于MorL組（P＜0.01），表明LiCl逆轉了嗎啡對LoVo細胞增殖抑制的作用，減弱了嗎啡對LoVo細胞凋亡促進作用，回調了嗎啡對LoVo細胞Bax和cleaved caspase 3蛋白表達水平的抑制作用。Gaspari等[20]研究發現，嗎啡可以通過WNT/β-catenin信號轉導途徑延緩鎮痛耐受的發展。另外，Wang等[21]報道指出，嗎啡可以通過WNT/β-catenin信號轉導途徑保護人神經母細胞瘤SH62SY5Y細胞免受分泌蛋白DKK1誘導的細胞凋亡。本研究與以上研究結果相似，說明嗎啡可能通過WNT/β-catenin信號通路參與結腸癌細胞增殖和凋亡的調控。關于嗎啡激活WNT/β-catenin信號通路的具體分子機制目前尚不清楚，這也是本實驗接下來需探究的方向。

綜上所述，嗎啡能夠在體外抑制人結腸癌Lo-Vo細胞的增殖，誘導LoVo細胞凋亡，其作用機制可能與嗎啡抑制WNT/β-catenin信號通路的活化有關，然而嗎啡激活WNT/β-catenin信號通路的具體分子機制仍需進一步研究。