欣胃顆粒及其拆方對胃癌前病變大鼠Axin、APC基因表達影響的研究 Δ

張楊，沈文娟，謝晶日，王靜濱，劉朝霞，孫濤，張冰

黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院1肝脾胃科，2婦科，哈爾濱1500360

胃癌前病變（precancerous lesions of gastric carcinoma，PLGC）是從病理學角度提出的概念，指胃黏膜具有惡性轉化可能性的病理學改變，其包括慢性萎縮性胃炎并伴有腸上皮化生和異型增生的一種病理狀態。根據Correa級聯學說，胃黏膜癌變是多階段的動態演變過程，通常要經歷一個相對較長的PLGC階段，此階段是胃癌轉變的重要節點，并具有雙向轉化的特點[1]。由于PLGC具有雙向轉變的特點，所以其在胃癌的發生、發展中起著關鍵性作用。相關研究表明，胃癌的發生與不恰當地激活WNT信號轉導通路密切相關[2]。與西醫治療相比，中醫藥治療PLGC的優勢突出[3-4]，且起到細胞逆轉及腺體重建的作用。本研究基于前期多項實驗研究及臨床觀察的基礎上[5-7]，探究欣胃顆粒及其拆方干預對PLGC大鼠WNT信號通路中軸蛋白（Axin）和結腸腺瘤樣息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC）表達的影響，揭示欣胃顆粒的作用機制以及拆方后各法之間的協調作用，旨在為優化組方及胃癌的有效防治提供參考，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取Wistar健康雄性大鼠[由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號：SCKK（黑）2008004]360只，體重為（200±20）g。

1.2 實驗藥物及試劑

欣胃顆粒：每劑由黃芪（每袋10 g）2.5袋；白術（每袋10 g）2.0袋；石斛（每袋10 g）1.5袋；沙參（每袋10 g）1.5袋；三棱（每袋10 g）1.5袋；莪術（每袋10 g）1.5袋；蛇莓（每袋10 g）1.5袋；半枝蓮（每袋15 g）2.5袋組成，均購自江陰天江藥業有限公司。胃復春（由香茶菜、紅參、枳殼等組成）購自杭州胡慶余堂藥業。N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）購自日本東京化成工業株式會；Axin、APC試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 方法

1.3.1 分組 將360只Wistar健康雄性大鼠適應性喂養7天后，根據隨機數字表法分為空白組、模型組、胃復春組和中藥組，其中中藥組又分為中藥單法組[益氣法（藥用黃芪、白術）、養陰法（藥用石斛、沙參）、化瘀法（藥用三棱、莪術）、解毒法（藥用蛇莓、半枝蓮）4組]、中藥雙法組[益氣養陰法（藥用黃芪、白術、石斛、沙參）、益氣化瘀法（藥用黃芪、白術、三棱、莪術）、益氣解毒法（藥用黃芪、白術、蛇莓、半枝蓮）、養陰化瘀法（藥用石斛、沙參、三棱、莪術）、養陰解毒法（藥用石斛、沙參、蛇莓、半枝蓮）、化瘀解毒法（藥用三棱、莪術、蛇莓、半枝蓮）6組]、中藥三法組[益氣養陰化瘀法（藥用黃芪、白術、石斛、沙參、三棱、莪術）、益氣養陰解毒法（藥用黃芪、白術、石斛、沙參、蛇莓、半枝蓮）、益氣化瘀解毒法（藥用黃芪、白術、三棱、莪術、蛇莓、半枝蓮）、養陰化瘀解毒法（藥用石斛、沙參、三棱、莪術、蛇莓、半枝蓮）4組]、中藥四法組[益氣養陰化瘀解毒法（藥用黃芪、白術、石斛、沙參、三棱、莪術、蛇莓、半枝蓮）]，共計18組，每組20只。

1.3.2 模型制備 根據MNNG自由飲用，雷尼替丁標準飼料喂養，熱鹽水灌胃，同時配合饑飽失常的復合造模方法構建胃癌前病變動物模型。模型組、胃復春組和中藥各組大鼠給予100 μg/ml MNNG溶液作為飲用水自由飲用，含0.3 g/kg雷尼替丁的標準飼料喂養，60℃150 g/L熱鹽水每日按10 ml（/kg·d）灌胃，同時配合饑飽失常（2天飽食，1天禁食），連續16周造成大鼠PLGC病變模型。空白組大鼠正常進食進水。

1.3.3 藥物干預PLGC大鼠造模成功后，胃復春組、中藥各組大鼠分別給予相應藥物干預，具體方法：每日下午給予各組大鼠按10 ml（/kg·d）相應的藥物灌胃，胃復春組給予濃度為0.04 g/ml的胃復春制劑，中藥各組給予濃度為1.5 g/ml的對應組方顆粒，模型組和空白組大鼠給予0.9%的生理鹽水灌胃，連續給藥16周。

1.3.4 胃黏膜組織中Axin、APC基因相對表達量的檢測 藥物干預結束后，所有大鼠均禁食24 h（自由飲水），然后全部烏拉坦麻醉，迅速剖腹取胃，沿胃大彎剪開，采用預冷的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗，將胃組織平鋪于冰盤上，肉眼觀察了解胃黏膜的變化情況后，于胃竇部剪取黃豆大組織2塊，液氮處理后于-86℃超低溫保存，將胃黏膜組織按照RNeasy Mini Kit的操作步驟提取細胞總RNA，同時按照離心柱型高純總RNA快速提取試劑盒中的步驟對提取的總RNA進行純化。將獲取的總RNA經逆轉錄聚合酶鏈反應獲取實驗所需的cDNA。引物序列為：βactin上游引物：3'-CGCGAGAAATGACCCAGAT-5'，下游引物：3'-GTACGGCCAGAGGCGTACAG-5'；Axin上游引物：3'-CCACAGAAATAGTAGGCCACA-5'，下 游 引 物 ：3'-GGAGGAAGAAGAAAAGAGAGC-5'；APC上游引物：3'-GATAAGGACGATATGTCACG-5'，下 游 引 物 ：3'-TGAATGATGTTGTGGAGGGC-5'。 按 照 Takara 試劑盒說明書進行操作，20 μl反應體系擴增，反應條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s進行變性、退火、延伸，共40個循環，反應結束后對每組獲取的Ct值，應用2-△△Ct方法定量檢測基因的表達情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 15.0軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1胃黏膜組織中AxinmRNA、APCmRNA表達情況的比較

與空白組比較，模型組、胃復春組和中藥各組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA、APCmRNA的相對表達量均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，胃復春組和中藥各組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA、APCmRNA相對表達量均增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與胃復春相比較，中藥單法組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA相對表達量均降低，中藥三法組和中藥四法組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA相對表達量均增高，中藥單法組、中藥雙法組、中藥三法組和中藥四法組大鼠胃黏膜組織中APCmRNA的相對表達量均增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與中藥四法組比較，中藥單法組、中藥雙法組、中藥三法組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA、APCmRNA的相對表達量均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組別大鼠胃黏膜組織中Axin mRNA、APC mRNA相對表達量的比較（±s）

表1 不同組別大鼠胃黏膜組織中Axin mRNA、APC mRNA相對表達量的比較（±s）

注：a與空白組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與胃復春組比較，P＜0.05；d與益氣養陰化瘀解毒組比較，P＜0.05；實驗過程中大鼠有死亡，故部分組別大鼠例數小于20例

組別空白組（n=19）模型組（n=16）胃復春組（n=20）中藥單法組益氣組（n=20）養陰組（n=20）化瘀組（n=20）解毒組（n=20）中藥雙法組益氣養陰組（n=19）益氣化瘀組（n=19）益氣解毒組（n=18）養陰化瘀組（n=19）養陰解毒組（n=18）化瘀解毒組（n=18）中藥三法組益氣養陰化瘀組（n=16）益氣養陰解毒組（n=18）益氣化瘀解毒組（n=18）養陰化瘀解毒組（n=18）中藥四法組益氣養陰化瘀解毒組（n=18）Axin mRNA 468.87±9.57 103.03±6.32a 277.86±15.27a b APC mRNA 1.06±0.07 0.09±0.01a 0.13±0.02a b 213.95±16.84a b c d 211.26±17.88a b c d 208.67±30.34a b c d 206.12±21.43a b c d 0.26±0.02a b c d 0.25±0.03a b c d 0.26±0.03a b c d 0.26±0.04a b c d 247.60±4.39a b d 230.49±31.62a b d 260.73±28.06a b d 246.53±23.40a b d 268.55±21.35a b d 261.39±24.40a b d 0.32±0.01a b c d 0.33±0.03a b c d 0.34±0.0a b c d 0.34±0.04a b c d 0.34±0.03a b c d 0.35±0.03a b c d 315.05±13.00a b c d 332.70±7.27a b c d 306.96±12.27a b c d 347.48±25.77a b c d 0.46±0.05a b c d 0.46±0.04a b c d 0.49±0.02a b c d 0.46±0.02a b c d 457.10±9.44a b c 0.94±0.04a b c

3 討論

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一。國家癌癥中心報告顯示，2015年中國胃癌發病率居惡性腫瘤第2位，較2013年明顯升高，病死率居惡性腫瘤第2位[8]。PLGC是正常黏膜向胃癌惡性轉化的一個重要階段，且具有雙向轉變的特點。因此，PLGC大鼠模型的成功建立與探索PLGC的發病機制、進展過程及尋找行之有效的預防和治療方法意義重大。WNT信號轉導通路參與調節細胞生長、增殖、分化及凋亡等過程，細胞發育、形態改變以及相鄰細胞之間的相互作用均與WNT信號通路密不可分。相關研究表明，WNT信號轉導通路失衡、異常活化是胃癌發生的重要影響因素[8-12]，信號蛋白、跨膜受體、胞質蛋白和核內轉錄因子等是WNT信號通路的異常活化因子。而Axin和APC蛋白是WNT信號轉導通路中的重要組成因子，其活性異常與胃癌的發生密切相關。WNT信號通路發生缺陷時可導致發育缺陷，而癌基因、抑癌基因或WNT信號通路成分的突變使該通路不恰當地激活而導致消化道腫瘤發生，而在此過程中，Axin、APC蛋白呈現低表達狀態。

PLGC主要歸屬中醫學“痞滿”范疇，據相關文獻報道，中醫藥治療PLGC的療效顯著，并且可以達到細胞逆轉和腺體重建的作用[13-15]。本研究旨在對PLGC大鼠進行干預治療，研究欣胃顆粒及其拆方后“益氣”“養陰”“化瘀”“解毒”各法及其組合對WNT信號通路關鍵因子AxinmRNA和APCmRNA表達的影響，有望優化藥物組方，選擇可靠、有效的切入點，對腸上皮化生、異型增生等PLGC進行阻斷和干預治療。本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA和APCmRNA相對表達量均降低（P＜0.05）；但中藥干預后，胃復春組和中藥各組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA和APCmRNA相對表達量均升高（P＜0.05），而且其調控改善效果由低到高依次為中藥單法組、中藥雙法組、中藥三法組、中藥四法組，表明中藥各法間可能存在協同作用，而中藥益氣養陰化瘀解毒四法組的調控作用最佳。

綜上所述，PLGC的基本病理機制多為本虛標實、虛實夾雜，中藥益氣養陰化瘀解毒法可顯著改善PLGC的狀態，對WNT信號通路上的Axin和APC因子的表達具有顯著調節作用，此作用靶點可作為中藥益氣養陰化瘀解毒法防治PLGC的機制之一，這也可為將來進一步的實驗研究提供思路和研究基礎。