肺癌患者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141的表達及臨床意義

鄧超，譚建軍，朱川，黃小平，任必勇，吳佼佼，黃羽

重慶三峽中心醫院腫瘤科，重慶4041000

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，其病理類型包括腺癌、鱗癌和小細胞癌等，其中腺癌在所有類型肺癌中所占比例呈上趨勢[1]。流行病學研究表明，肺癌的發病率和病死率居中國惡性腫瘤的首位[2]。目前臨床肺癌的治療方法多為手術及放化療等，但效果有限。近幾年，隨著分子生物學研究的深入，腫瘤的靶向治療策略被提出，該治療方法具有針對性強、不良反應少等優點。Cheng等[3]的研究顯示，將antimiRNA靶向輸送至酸性腫瘤微環境后，其可通過抑制miRNA-155表達，抑制腫瘤進展。研究表明，miRNA-200家族控制與乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤轉移密切相關的上皮-間充質轉化過程，可能成為多種腫瘤的診斷標志物[4-5]。另外，血清中miRNA方便提取且極易檢測，miRNA可能成為診斷肺癌的生物標志物，也可能成為肺癌靶向治療的靶點。本研究選取miRNA-200家族中具有代表性的miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141進行研究，旨在通過評估肺癌患者血清中miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的表達水平，明確miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141診斷肺癌的價值，探討血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141水平與肺癌患者臨床特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年11月至2014年12月于重慶三峽中心醫院診治的肺癌患者。納入標準：①接受了腫瘤減滅術治療；②經術后病理活檢確診為原發性肺癌，且為初診病例；③臨床及隨訪資料完整。排除標準：①有其他原發腫瘤；②合并其他重要器官功能障礙。根據納入、排除標準，共納入96例肺癌患者（肺癌組），其中男45例，女51例；年齡為24～78歲，平均年齡為（50.47±10.23）歲；小細胞肺癌25例，肺腺癌19例，肺鱗狀細胞癌42例，其他10例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲa期65例；腫瘤直徑：＞3 cm 59例，≤3 cm 37例；有淋巴結轉移51例，無淋巴結轉移45例。選取同期95例健康體檢者作為健康對照組，其中男46例，女49例；年齡為22～79歲，平均年齡為（51.89±11.72）歲。兩組受試者的年齡、性別比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol RNA提取試劑購自日本Takara公司，MystiCq?miRNA實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒、mirPremier?miRNA分離萃取試劑盒均購自美國Sigma公司，熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海生工生物公司合成，熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 檢測方法

采用qRT-PCR檢測肺癌患者和健康體檢者的血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的表達情況。Trizol法提取血清總RNA，采用反轉錄試劑盒反轉錄獲得cDNA。采用定量PCR儀對miRNA-200b、miRNA-200c和 miRNA-141進行擴增。反應體系：正、反引物（10μmol/l）各0.5μl，聚合酶和綠色熒光染料的預混液5.0μl，cDNA（50 ng/μl）1.0μl，qRT-PCR試劑盒中水3.0μl，共10μl。反應條件設置如下：95℃ 90 s，95℃ 30 s，62℃30 s，72℃20 s，共40個循環。反應結束后，采用2-ΔΔCT法對 miRNA-200b、miRNA-200c和 miRNA-141在不同血清樣品中的相對表達量進行分析。以U6為內參，qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 觀察指標

比較兩組患者miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的相對表達量，并采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清 miRNA-200b、miRNA-200c和 miRNA-141對肺癌的診斷效能，及其與肺癌患者的臨床特征[性別、年齡、吸煙情況、病理類型、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結轉移情況、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角質蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）、神經元特異性稀醇化酶（neuron specific enolase，NSE）]及預后的關系。

1.5 隨訪

所有肺癌患者均接受了門診復診或電話隨訪，每月1次，隨訪截止時間為2017年11月30日。隨訪終止事件：患者死亡。隨訪期間無患者失訪。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件分析數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，生存分析采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141相對表達量的比較

肺癌組患者血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的相對表達量均明顯低于健康對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 兩組受試者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141相對表達量的比較（±s）

表2 兩組受試者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141相對表達量的比較（±s）

組別健康對照組（n=95）肺癌組（n=96）t值P值miRNA-200b 1.02±0.21 0.75±0.15 10.233 0.000 miRNA-200c 1.01±0.19 0.79±0.16 8.659 0.000 miRNA-141 1.05±0.22 0.64±0.13 15.699 0.000

2.2 血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141診斷肺癌的ROC曲線分析

miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141診斷肺癌的ROC曲線下面積分別為0.749（95%CI：0.672～0.865，P＜0.05）、0.746（95%CI：0.669～0.853，P＜0.05）、0.827（95%CI：0.718～0.932，P＜0.05），分別取 miRNA-200b=0.84、miRNA-200c=0.89、miRNA-141=0.75為截斷值，其靈敏度分別為78.15%、54.71%、84.13%，特異度分別為68.41%、84.65%、75.32%。（圖1～3）

圖1 血清miRNA-200 b診斷肺癌的ROC曲線

圖2 血清miRNA-200 c診斷肺癌的ROC曲線

圖3 血清miRNA-141診斷肺癌的ROC曲線

2.3 不同臨床特征肺癌患者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141表達情況的比較

分別以0.84、0.89、0.75為截斷值，將肺癌患者分為miRNA-200b低表達（≤0.84）59例、高表達（＞0.84）37例，miRNA-200c低表達（≤0.89）53例、高表達（＞0.89）43例，miRNA-141低表達（≤0.75）63例、高表達（＞0.75）33例。不同TNM分期的肺癌患者血清miRNA-200b、miRNA-200c的表達情況比較，差異均有統計學意義（χ2=7.367、5.040，P＜0.05）；不同病理類型、SCC水平的肺癌患者血清miRNA-141的表達情況比較，差異均有統計學意義（χ2=17.176、16.221，P＜0.01）；不同性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、淋巴結轉移情況、CEA水平、CYFRA21-1水平、NSE水平的肺癌患者血清miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同病理類型、SCC水平的肺癌患者血清miRNA-200b、miRNA-200c表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期的肺癌患者血清miRNA-141表達情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征的肺癌患者血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141的表達情況

表3 （續）

2.4 血清miRNA-200 b、miRNA-200 c和miRNA-141相對表達量對肺癌患者預后的影響

隨訪3年，96例肺癌患者中生存37例，占38.54%。miRNA-200b高表達患者的3年生存率為62.16%（23/37），高于miRNA-200b低表達患者的23.73%（14/59）（χ2=14.180，P＜0.05）；miRNA-200c高表達患者的3年生存率為58.14%（25/43），高于miRNA-200c低表達患者的 22.64%（12/53）（χ2=12.629，P＜0.05）；miRNA-141高表達患者的3年生存率為63.64%（21/33），高于miRNA-141低表達患者的25.40%（16/63）（χ2=13.369，P＜0.05）。（圖4～6）

圖 4 miRNA-200 b低表達患者（ n=59）與高表達患者（ n=37）的 3年生存曲線

圖5 miRNA-200 c低表達患者（ n=53）與高表達患者（ n=43）的 3年生存曲線

圖6 miRNA-141低表達患者（ n=63）與高表達患者（ n=33）的 3年生存曲線

3 討論

肺癌是威脅人們身體健康和生命安全的常見惡性腫瘤。隨著診療技術的提高，肺癌的治療效果進一步提高，但其5年生存率仍不理想[6]。根據第8版肺癌TNM分期建議，從早期肺癌（Ⅰa～Ⅱb）進展至中晚期（Ⅲa～Ⅲc）的過程中，患者60個月生存率從55%～90%下降至12%～41%，中晚期肺癌治療難度極大，病情兇險，易復發，病死率高[7]。不良的生活習慣、環境因素及遺傳易感因素等均可能導致肺癌的發生，但其具體的發病機制尚不清楚。因此，研究肺癌的發生發展機制，尋找與肺癌發生發展相關的生物標志物，可為肺癌早期診斷、后期靶向治療及改善患者預后提供新的思路。

miRNA是真核生物細胞內由18～25個核苷酸組成的一類內源性單鏈非編碼RNA，具有高度保守性，能與靶基因miRNA非編碼區特異性結合，調節靶點基因沉默、蛋白質表達抑制等，在細胞增殖、細胞分化及細胞凋亡等生物學過程中發揮非常重要的作用[8]。miRNA的異常表達在包括肺癌等多種疾病的發生發展中發揮重要的作用，在多種疾病中作為重要調節因子參與疾病發生[9]。miRNA相對分子質量十分小，可以穿過細胞膜進入血液中，在血清或血漿中均勻分布，相對穩定且極易被檢測[10]。鑒于這些特點，血清miRNA可以作為多種疾病診斷的潛在生物標志物，具有較好的應用前景。然而，目前關于肺癌患者血清miRNA表達模式的研究相對較少。

miRNA-200家族是一類常見的哺乳動物miRNA之一，存在于多種細胞、組織中，包括miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141等[11]。研究表明，miRNA-200家族主要參與調節上皮-間充質轉化過程，調節細胞分裂和凋亡，調節腫瘤干細胞的自我更新和分化過程，逆轉腫瘤細胞的化療耐藥性，不僅在機體正常發育過程中起著重要的作用，而且在包括惡性腫瘤在內的多種疾病中也普遍存在失調[12]。Liu 等[13]發現，miRNA-200c在膀胱癌組織和細胞中的表達顯著下調，過表達miRNA-200c可顯著降低膀胱癌細胞的侵襲、遷移和增殖能力，提示miRNA-200c可能作為抑癌因子參與膀胱癌發展。Manavalan 等[14]研究表明，miRNA-200b、miRNA-200c在乳腺癌細胞系LY2細胞中的表達下調，過表達miRNA-200b或miRNA-200c可改變細胞形態，抑制細胞遷移，降低細胞對雌激素受體拮抗劑的敏感性，提示miRNA-200b、miRNA-200c可能作為乳腺癌治療的生物靶點。另外，Xu等[15]在前列腺癌組織和細胞系檢測中發現，miRNA-141表達水平低，miRNA-141過表達顯著抑制前列腺癌細胞的生長和侵襲，促進細胞凋亡，提示miRNA-141在前列腺癌進展過程中發揮重要的作用，可能成為前列腺癌診斷和治療的靶點。Nishijima等[16]發現，miRNA-200b、miRNA-141在肺癌細胞中的表達下調，過表達miRNA-200b可扭轉肺癌細胞的耐藥性。基于以上研究結果，本研究推測miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141可能參與肺癌的發生和進展，但其在肺癌發生、進展中的作用尚不清楚。因此，本研究檢測了miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141在肺癌患者血清中的表達情況，結果顯示，肺癌組患者血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的相對表達量均明顯低于健康對照組。這與miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141在膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌中的表達情況一致[13-15]，表明 miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的表達下調可能是肺癌發生的原因之一。ROC曲線分析顯示，miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141診斷肺癌的曲線下面積分別為0.749、0.746和 0.827，表明 miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141對肺癌患者和健康體檢者有較強辨別診斷效能，提示檢測血清miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141可用于肺癌的初步篩查，且miRNA-141的診斷效能更強。進一步分析表明，血清miRNA-200b、miRNA-200c的表達情況與肺癌患者TNM分期有關，Ⅲa期患者血清miRNA-200b、miRNA-200c低表達的比例分別為70.77%（46/65）、63.08%（41/65），分別高于Ⅰ～Ⅱ期患者的 41.94%（13/31）、38.71%（12/31）。TNM 分期可反映腫瘤的惡性程度，分期越高，腫瘤的惡性程度越高，提示miRNA-200b、miRNA-200c可能參與肺癌的進展，其表達情況與腫瘤的惡性程度有關。本研究顯示，血清miRNA-141的表達情況與肺癌患者的病理類型和SCC水平有關（P＜0.01）。另外，本研究發現，miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141低表達患者的3年生存率均分別低于miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141高表達患者，提示miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141表達與肺癌患者3年生存率有關，低表達的肺癌患者預后不良，推測 miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141可作為評估肺癌患者預后的生物標志物。然而 miRNA-200b、miRNA-200c和 miRNA-141參與肺癌發生、發展的具體機制有待進一步證實，將在后續研究中進行分析。

綜上所述，miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141在肺癌患者血清中的相對表達量較低，對肺癌具有較高診斷價值，與肺癌患者3年生存率有關，推測miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141可能作為抑癌因子參與肺癌疾病進程，為肺癌的精準治療提供了新的思路。