乙肝病毒基因分型與原發性肝癌關系研究

王超　林松斌　許天獎　尹毅銳

【摘要】 目的：研究乙型肝炎病毒（HBV）基因分型及其與原發性肝癌的關系。方法：回顧性收集復旦大學附屬中山醫院2015年1月1日-12月31日符合入組條件的慢性乙型病毒性肝炎患者，按照是否合并肝癌分為肝癌組（182例）與非肝癌組（189例），通過留取血清來完善乙型肝炎病毒基因分型及相關耐藥性檢測。結果：371例乙肝患者，其中B型95例，C型患者276例;肝癌患者較非肝癌乙肝人群中HBV C型較B型所占比例顯著高（字2=6.366，P=0.012），肝癌患者中HBV C型較B型突變比率（耐藥性）顯著高（字2=6.777，P=0.009）。結論：相較乙肝人群中，HBV C型在乙肝相關的肝癌患者中占有更高的比例和突變率;相較B型也有更高的突變率;提示HBV C型突變型在肝癌發生中可能存在一定的作用。

【關鍵詞】 HBV基因分型; 原發性肝癌; 耐藥性

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.08.002 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）08-000-03

A Research on the Relationship between Hepatitis B Virus Genotyping and Primary Carcinoma of Liver/WANG Chao，LIN Songbin，XU Tianjiang，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（8）：-5

【Abstract】 Objective：To study the genotyping of hepatitis B virus（HBV） and its relationship with primary carcinoma of liver.Method：Retrospectively collected affiliated Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University on January 1，2015 and December 31，2015，complied with the conditions set of chronic hepatitis B patients with viral hepatitis，according to whether the merger of liver cancer divided into cancer group（182 cases） and non-cancer group（189 cases），through to return to improve serum hepatitis B virus genotyping and related drug resistance test.Result：There were 371 patients with hepatitis B，including 95 patients with type B and 276 patients with type C.The proportion of HBV type C in cancer patients was significantly higher than that of non-cancer patients

（字2=6.366，P=0.012），and the mutation（drug resistance） rate of HBV type C in cancer patients was significantly higher than that of type B （字2=6.777，P=0.009）.Conclusion：Compared with hepatitis B patients，HBV type C has a higher proportion and mutation rate in HBV-related liver cancer patients.It also has a higher mutation rate than type B.It suggests that HBV C type mutation may play a role in the occurrence of primary carcinoma of liver.

【Key words】 Hepatitis B virus gene type; Primary carcinoma of liver; Drug resistance

First-authors address：Xiamen Branch Zhongshan Hospital of Fudan University，Xiamen 361015，China

慢性乙型病毒型肝炎（HBV）是由乙型肝炎病毒所致的肝臟炎癥性疾病，歷經1965-1979年國外相關學者研究發現后正式予以命名，因其在全世界范圍流行，在中國更是病毒性肝炎的常見病因[1]。據調查，目前全世界大約20億人感染過HBV，最終有3.5億人發展為慢性乙型肝炎感染者[2]，而在這當中中國則以60歲以下發病為主。HBV的基因型不同，不同基因型的臨床和病理特征也不同。原發性肝癌是中國常見惡性腫瘤死亡的第三大原因，嚴重威脅著我國人民的生命和健康。在這當中以肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）多見，占85%～90%。在中國，HCC的發生率占世界的55%，約90%為乙肝肝炎相關的肝癌[3]。研究表明，長期的慢性乙型病毒復制沒有控制，后期容易漸漸并發肝硬化甚至肝癌的發生。不同類型的HBV可能與HBV突變有關，因此本回顧性研究旨在探討HBV基因分型與原發性肝癌之間可能存在的關系，從而更好予以臨床指導和規范治療作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月1日-12月31日，于復旦大學附屬中山醫院完善血清乙型肝炎病毒五項檢測的患者，納入標準根據文獻[4]中華醫學會肝病科和傳染病科的“慢性乙型肝炎防治指南”的修訂，診斷標準分類。排除標準：其他肝臟相關病毒（甲型、丙型、丁型、戊型肝炎）的重疊感染;由脂肪、酒精、藥物、自身免疫等其他因素引起的各類肝臟損傷;合并原發性肝癌除外的其他惡性腫瘤病史。共有371例患者符合條件入組，按照是否合并肝癌分為肝癌組（182例）與非肝癌組（189例），通過留取血清來完善乙型肝炎病毒基因分型及相關耐藥性檢測。

1.2 儀器與試劑

測定乙型肝炎病毒基因分型及相關耐藥性檢測儀器分別為Roche Light Cycler480熒光定量PCR儀，Roche公司生產;ABI3130基因測序儀，美國應用生物系統公司（ABI）生產。試劑盒是由上海申友生物技術有限責任公司提供（產品貨號：YZB/國0080-2009）。

1.3 方法

通過PCR擴增技術結合熒光探針雜交技術對乙型肝炎病毒DNA進行檢測，并根據其產物通過測序分析來達到完成基因分型及耐藥突變點的檢測。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0對肝癌組及非肝癌組所測的基因各分型及耐藥性結果進行分析，率的比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

在符合入組條件的兩組人群371例中，男285例及女86例，平均年齡（49.95±13.65）歲。

2.2 分型情況

在肝癌組中182例中，乙肝基因分型B型36例，乙肝基因分型C型146例;在非肝癌組189例中，乙肝基因分型B型59例，乙肝基因分型C型130例。在肝癌組中182例中，乙肝基因野生型67例，乙肝基因突變型（耐藥型）115例;在非肝癌組189例中，乙肝基因野生型105例，乙肝基因突變型（耐藥型）84例。肝癌患者較非肝癌乙肝人群中HBV C型較B型所占比例顯著高，差異有統計學意義（字2=6.366，P=0.012），見表1。肝癌患者較非肝癌乙肝人群中HBV突變型（耐藥型）所占比例顯著高，差異有統計學意義（字2=13.097，P<0.001），見表2。

2.3 不同分型的耐藥性

HBV B型在肝癌患者較非肝癌乙肝人群比較中突變型（耐藥型）所占比例差異無統計學意義（字2=1.889，P=0.169），見表3。

HBV C型在肝癌患者較非肝癌乙肝人群比較中突變型（耐藥型）所占比例顯著高，差異有統計學意義（字2=8.304，P=0.004），見表4。

在肝癌組患者中的HBV C型較B型突變比率（耐藥性）顯著高，差異有統計學意義（字2=6.777，P=0.009），見表5。

3 討論

慢性乙型病毒性肝炎是我國最常見的病毒性肝炎及肝功能異常的病因之一，新中國成立以來的廣泛流行及在人群中受累均受到國內學者的關注;中國是HBV感染的高危地區，有近1億HBV攜帶者，其中20%～30%患有肝硬化和肝癌等嚴重疾病，且呈逐年遞增趨勢[5]。對HBV的研究中，歷經1965-1979年國外相關學者研究發現后正式予以命名，直至1988年國外學者才首次報道HBV基因分型，不同的毒株長期與環境間的突變進化，導致了A-H等8種分型[6-7]，近年來有文獻[8-9]顯示另有新的亞型I、J2型出現，但還存在著爭議。據研究發現，HBV基因型的分布存在種族和地理差異，A型更多地分布在歐洲和中非地域;亞洲的主要流行病型是B和C型;具體到中國的情況則是南部有多種B型，北部有C型，另外我國亦存在極少見的A型基因型存在[10]。不同基因型的流行病學和臨床特征也不同，與肝臟病變程度和藥物治療效果有一定的相關性[11]，影響著疾病的預后及病情的轉歸。在這項回顧性研究中，目前就診患者的基因型仍然主要是B和C。其中C型占優勢，這一點與之前研究基本相仿，但因筆者所在醫院患者就診特殊性，具體南北或江浙一帶分型趨勢，無法較前比較造成了數據差異。

原發性肝癌也是世界范圍內常見的惡性腫瘤，其發病隱匿，在起病早期缺乏相關典型的臨床癥狀。其發病兇險，中位生存期短，晚期治療效果欠佳為重要特征。而在我國更是高發，據文獻[12]統計，截至2016年，我國的原發性肝癌已占據全球的55%，發病率及死亡率繼續每年遞增，也是我國因腫瘤死亡的第三位，僅僅次于胃癌、肺癌[13]。原發性肝癌的危險因素受多種因素、多因素和多種途徑的影響。然而，慢性病毒性肝炎，尤其是慢性乙型肝炎，在肝癌的發生中起重要作用。在西方發達國家中，與原發性肝癌發生相關的肝炎，乙肝、丙肝均有，我國是乙肝大國，中國肝癌發病率高與慢性乙型肝炎的發病有很大關系。有研究報道乙型肝炎病毒載量和活躍復制與原發性肝癌的發生密切相關[14]。乙型肝炎病毒中的X蛋白直接激活原癌基因并使腫瘤抑制基因p53和p16失活。另一方面乙肝病毒復制活躍早期也通過損傷正常的肝細胞、炎癥進展從而促進肝臟腫瘤發生，特別是HBeAg也會幫助乙肝病毒避開免疫系統及作為靶抗原誘導免疫細胞攻擊被感染的肝細胞促進這一過程;而乙肝病毒的耐藥和突變會通過調控pg RNA轉錄，導致HBV基因組復制及加速腫瘤發生率[15]，本回顧性研究中的肝癌患者較非肝癌乙肝在人群中HBV突變型（耐藥型）所占比例顯著高（P<0.001），也恰好驗證了這一觀點。雖然病毒突變對肝癌的發生存在作用，但是在本研究中，B型患者在肝癌患者較非肝癌乙肝人群比較中突變型（耐藥型）所占比例差異無統計學意義（P>0.05），表明了乙肝基因分型B型患者可能在其耐藥菌株的突變變異對肝臟腫瘤的發生無明顯作用，國內外文獻目前鮮見關于此方面的報道，亦有可能與個體差異及樣本量不大存在相關。乙型肝炎病毒基因分型C型患者，在本研究中，在肝癌患者較非肝癌乙肝人群比較中突變型（耐藥型）所占比例顯著高（P=0.004），且在肝癌人群中較B型的突變比率（耐藥性）也是顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），這表明在乙型肝炎進展為肝癌的過程中，C型基因的發病率較高。這點與國內學者文獻[16-17]報道研究是一致的。研究表明，B型患者較C型患者的HBeAg陽性低、血清轉換高，從而發生肝癌的風險會低于C型基因[18]，這可能導致B和C基因型差異的存在，本文未做深一步地探討。近年來國內學者司書梅等[19]的meta分析也驗證了這一觀點，且C型基因會較B型基因更容易引起耐藥突變及多基因點突變[20]，從而引發免疫逃逸最終增加腫瘤發生。

綜上所述，本研究總結了乙肝基因型與肝癌的相關性研究，相較乙肝人群中，HBV C型在乙肝相關的肝癌患者中占有更高的比例和突變率;相較B型也有更高的突變率;提示HBV C型突變型在肝癌發生中可能存在一定的作用，但仍需進一步完善關于乙肝及肝癌的臨床資料，必要時擴充病例數，并積極參與乙肝病毒全外顯子測序結果分析，進一步發掘研究的不同方向;另一方面，乙肝病毒的耐藥性，特別是未用過核苷酸類似物藥物患者具有耐藥性及發生多重耐藥現象預示著乙肝基因耐藥性在肝病進展研究中的重要性。研究還表明，積極有效抗病毒治療可以減輕病毒復制，減少對肝臟的損害，從而降低肝癌的發病率[21]，故臨床上可以根據乙肝基因分型及耐藥突變合理診斷及選擇合適抗病毒治療方案加以干預，從而降低肝癌及終末期肝病的發生率，為慢乙肝患者提供較好的預后。

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