Yap介導瑞芬太尼預處理促進肝切除小鼠術后肝再生

殷蘇晴 朱 玲 楊瑜汀 崔 璀 高 雄 高 坡 焦英甫 楊立群

瑞芬太尼是臨床麻醉中常用的阿片類鎮痛藥物。已有大量研究結果表明，瑞芬太尼對于肝臟手術過程中的相關臟器損傷具有一定的保護作用[1-2]，同時在一定程度上具有維持血流動力學穩定、縮短機械通氣時間、保護肝功能等優點[3-4]。本課題組的前期研究首次闡明了瑞芬太尼對于肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及其可能機制[5]。在肝再生模型中，70%肝切除后剩余的部分肝臟不可避免地遭受氧化應激損傷，瑞芬太尼在肝切除后的肝再生過程中的作用尚無相關研究。本研究旨在探討瑞芬太尼預處理對于70%肝臟切除術后肝再生的作用及其可能機制，為臨床圍術期應用瑞芬太尼提供更多的依據和支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，購自上海必凱實驗動物有限公司。Ki-67(#12202)、Yap(#14074)、磷酸化Yap(p-Yap，#4911)、GAPDH(#97166)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒購自日本TAKARA生物科技有限公司，TRIzol和實時熒光定量核酸擴增檢測系統的SYBR GREEN購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 70%肝切除模型的建立和分組 實驗動物予適應性喂養1周后，將其隨機分入對照組和瑞芬太尼組。瑞芬太尼組小鼠在肝切除前20～30 min于腹腔內注射瑞芬太尼30 μg/kg(劑量依據本課題組前期實驗[6]結果)，對照組予等量0.9%氯化鈉溶液。之后用異氟烷麻醉小鼠，并采用改良Higgins和Anderson法行70%肝切除術。依據觀察時間點，分別在70%肝切除術后6、24、36、48、120、192 h收集小鼠的血清和肝臟標本。

1.3 肝體比 分別于70%肝切除術后6、24、36、48、120、192 h取血后摘取兩組小鼠剩余30%的肝臟組織，計算肝體比。肝體比=相應時間點再生后的殘肝濕重/小鼠基本體重。

1.4 Ki-67免疫組織化學檢測Ki-67陽性細胞率 取70%肝切除術后24、36、48、120、192 h的肝臟組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定脫水、石蠟包埋切片，而后脫蠟至水。用雙蒸水(ddH2O)清洗切片5 min×3次。將切片放入3%過氧化氫水溶液中，孵育10 min。用ddH2O清洗切片5 min×2次。用洗滌緩沖液清洗切片持續5 min。300 μL封閉液室溫下封閉1 h。300 μL一抗4 ℃孵育過夜。洗滌緩沖液清洗切片5 min×3次。在切片上滴加2或3滴SignalStain Boost Detection Reagent(HRP，Rabbit #8114)，置于濕盒中室溫孵育30 min。用洗滌緩沖液清洗切片5 min×3次。DAB顯色。將切片浸入ddH2O中洗滌，復染、脫水、封片。兩組各時間點每個樣本選取4個光學顯微鏡高倍鏡視野，應用Image J軟件進行分析，計算Ki-67陽性細胞數所占比例(陽性細胞率)。

1.5 實時定量PCR檢測表皮生長因子受體(EGFR)mRNA表達 采用TRIzol法提取70%肝切除術后6、24、36、48、120 h兩組樣本總RNA，并取1 μL于Nanodrop儀器上測量260/280 nm處的吸光度(A)值和RNA水平，通過TAKARA反轉錄試劑盒進行cDNA合成，反應條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃。使用SYBR GREEN進行PCR，獲得數據以相對定量(RQ)=2-ΔΔCT(CT為循環閾值)計算mRNA表達量，每個樣本對應每個引物添加3個復孔以縮小加樣誤差。引物序列：GAPDH正義鏈5’-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3’，反義鏈5’-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3’；EGFR正義鏈5’-ATG TCC TCA TTG CCC TCA AC-3’，反義鏈5’-GCA TGG GCA GTT CCC TAA G-3’。

1.6 Western印跡法檢測功能性Yap蛋白質表達 采用放射免疫沉淀試驗(RIPA)組織裂解液加苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的混合液提取70%肝切除術后120 h兩組總蛋白質，二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白質水平。依照每孔50 μg蛋白質用8%膠進行SDS-PAGE電泳。70 V、90 min轉膜。置于5%牛血清白蛋白(BSA)4 ℃搖床過夜封閉。Yap(1∶1 000)、p-Yap(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)一抗孵育，4 ℃搖床過夜。0.1%吐溫20 Tris緩沖液(TBST)洗膜，10 min×3次。二抗(1∶10 000)室溫孵育90 min。0.1%TBST洗膜，10 min×3次。顯影。以GAPDH作為內參，分析Yap和p-Yap條帶灰度變化。

2 結 果

2.1 瑞芬太尼預處理對肝切除術后小鼠肝體比的影響 瑞芬太尼組肝切除術后48和120 h的肝體比均顯著高于對照組同時間點(P值均<0.05)，兩組間肝切除術后6、24、36、192 h的肝體比的差異均無統計學意義(P值均>0.05)，見表1。

2.2 瑞芬太尼預處理對肝切除術后小鼠肝組織Ki-67表達的影響 兩組肝切除術后24、36、48、120、192 h肝臟標本Ki-67免疫組織化學染色結果見圖1。瑞芬太尼組肝切除術后36、48、120、192 h的Ki-67陽性細胞率均顯著高于對照組同時間點(P值分別<0.01、0.05)，兩組間肝切除術后24 h的Ki-67陽性細胞率的差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3 瑞芬太尼預處理對肝切除術后小鼠肝組織EGFR表達的影響 瑞芬太尼組肝切除術后6 h的EGFR mRNA水平顯著高于對照組同時間點(P<0.05)，兩組間肝切除術后24、36、48、120 h的EGFR mRNA水平的差異無統計學意義(P值均>0.05)，見表1。

表1 兩組小鼠70%肝切除術后各時間點肝體比、Ki-67陽性細胞率和EGFR mRNA水平比較

與對照組同時間點比較：①P<0.05，②P<0.01

紅色箭頭所示為Ki-67陽性細胞 A 對照組術后24 h B 對照組術后36 h C 對照組術后48 h D 對照組術后120 h E 對照組術后192 h F 瑞芬太尼組術后24 h G 瑞芬太尼組術后36 h H 瑞芬太尼組術后48 h I 瑞芬太尼組術后120 h J 瑞芬太尼組術后192 h 圖1 70%肝切除術后不同時間點兩組Ki-67陽性細胞率比較(Ki-67免疫組織化學染色，×20)

2.4 瑞芬太尼預處理對肝切除術后小鼠肝組織Yap和p-Yap蛋白質表達的影響 對照組和瑞芬太尼組肝切除術后120 h的肝組織Yap蛋白質相對表達量分別為1.039±0.117和0.978±0.099，差異無統計學意義(P>0.05)。瑞芬太尼組肝切除術后120 h的肝組織p-Yap蛋白質相對表達量為0.729±0.197，顯著低于對照組的0.944±0.077(P<0.05)。見圖2。

1～3 對照組 4～6 瑞芬太尼組 圖2 Western印跡法檢測70%肝切除術后120 h兩組Yap和p-Yap蛋白質的表達

3 討 論

圍術期肝功能的保護和恢復是決定部分肝切除術后患者生存率的重要因素。諸多研究[7-9]已經證實了瑞芬太尼對于多種臟器具有保護作用。本課題組的前期研究[5]結果表明，瑞芬太尼誘導產生的一氧化氮(NO)可通過耗盡活性氧和抑制炎性反應而減輕肝臟損傷。此外，外周和中樞的迷走神經系統也參與了瑞芬太尼對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用[10]。而在遭受外界一定程度的損傷之后，肝臟本身具有強大的再生能力，但目前尚無阿片類藥物與肝再生有關的確切研究報道。本研究結果表明，瑞芬太尼預處理可促進70%肝臟切除后的再生過程，不僅表現為促進肝體比的增加和Ki-67陽性細胞率的升高，同時促進了肝再生早期EGFR的表達和肝再生過程中功能性Yap表達的增加，該結果可能提供了新的角度來審視臨床瑞芬太尼的應用對于患者預后的影響。

本研究所記錄的瑞芬太尼預處理時間為從腹腔內注射瑞芬太尼開始至70%肝切除手術結束，受實驗操作過程的影響，預處理時間有一定的波動性，主要集中在20～30 min。為防止由瑞芬太尼預處理時間造成的差異偏倚，在本研究過程中對兩組預處理的時間進行匹配。本研究中所采用的動物模型是肝再生研究中的經典模型，于1931年由Higgins等提出。既往研究[11]結果已經證實，70%肝切除后5～7 d，小鼠的肝臟就可以恢復到原始大小，因此本研究選擇肝切除術后192 h作為研究終點，以明確瑞芬太尼促進肝再生的過程是促進其生理狀態的肝再生，即只是加快了肝切除后肝再生的進程，并不會影響肝再生的結局。Ki-67的免疫組織化學檢查結果顯示，從肝切除術后36 h起剩余30%肝臟中增殖細胞的數量便顯著增多，且到術后192 h時這種細胞增殖的狀態依舊存在，這與肝再生后不同時間點肝體比的變化趨勢基本一致。

在肝再生的過程中，肝臟細胞的周期進程受眾多有絲分裂相關生長因子的影響，其中EGFR在肝再生中扮演著重要角色[12]，其配體作為肝細胞主要的促有絲分裂原，通過結合于相應受體激活Ras-有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路，從而促進肝細胞的再生[13]。已有研究[14]結果證明，EGFR是肝再生初期肝細胞增殖的關鍵調節因子，在肝再生早期，其表達量顯著增加[15]。在本研究中，肝切除術后6 h瑞芬太尼組EGFR mRNA表達水平顯著高于對照組，可能因在一定程度上促進了早期的肝再生過程。

Hippo-Yap通路作為再生過程中的重要通路，參與多種器官再生修復的過程。而YAP的亞細胞定位受其磷酸化狀態的調節[16]，p-Yap保留在細胞質中并不進入核內發揮其轉錄共激活因子的作用，從而被降解。已有研究[17]結果表明，Yap的過表達可直接促進肝細胞的增殖。對于肝臟而言，活化的功能性Yap在70%肝切除后顯著增加，且其活化和核定位在肝再生的早期增加，并隨著肝再生和肝體比逐漸接近術前水平而呈降低趨勢[18]。

本研究結果表明，瑞芬太尼預處理可顯著增加肝臟中活化的Yap的表達，與Ki-67免疫組織化學檢查的結果相互印證，從而明確了瑞芬太尼促進肝再生的作用，提示瑞芬太尼預處理可能通過促進Yap的功能性活化從而促進70%肝切除后小鼠的肝再生。對于瑞芬太尼調節Yap活化的機制及其在促進肝再生過程中的重要性，尚需聯系其上下游分子進一步研究。就其臨床意義來說，瑞芬太尼可能會通過促進肝再生過程，使肝切除患者更早地恢復正常的肝臟體積和功能，從而改善患者的生存預后，但該結論尚需進一步的臨床研究支持。