套環法和空氣干燥法建立兔頸動脈粥樣硬化斑塊模型的比較分析

王 琮, 陳筱雪, 楊少玲, 王鳳翎, 范林艷, 賀倩倩

(安徽理工大學附屬上海市奉賢區中心醫院, 上海201400)

腦血管意外是全球發病率和死亡率最高的疾病之一, 研究[1]表明易損斑塊和急性腦血管意外有明顯關聯, 是腦缺血高發生率的重要原因。多數的急性腦血管意外是動脈粥樣硬化易損斑塊破裂和繼發血栓所致。因此，易損斑塊的特性及干預斑塊破裂導致的一系列病理生理過程成為當前的研究熱點。有關粥樣硬化易損斑塊的組織學研究主要依賴動物模型，由于兔在脂蛋白代謝方面與人有相似之處，且對血脂的清除能力低，進食含高膽固醇飼料后，短時間內可形成高膽固醇血癥，容易產生動脈粥樣硬化斑塊。因此，兔常用于構建動脈粥樣硬化易損斑塊動物模型。但有研究[3,4]指出單純給予兔高脂飲食，其產生的動脈斑塊更偏向于黃瘤病，而非類似于人動脈粥樣硬化斑塊。所以我們試圖通過不同方法來建立兔頸動脈粥樣硬化模型，尋找更高效的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級雄性新西蘭白兔20只，3～5月齡, 體質量2.0～2.5 kg，購自上海奉賢騰達兔業[SCXK(滬)2014-0003]，飼養于上海市奉賢輝煌實驗動物養殖場[SYXK(滬)2013-0047]。高脂飼料購自上海靈樸生物科技有限公司[蘇飼證(2014)01008]，配方(OC30002)如下： 普通飼料 74.5%，豬油10%，膽固醇0.5%，蛋黃粉10%，蔗糖5%。動物房溫度18～24℃、自然光照，晝夜交替12 h，每只兔喂飼料100 g/d，自由飲水，單籠喂養。按實驗動物使用3R原則對實驗兔給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

Vivid E9超聲診斷儀購自美國GE公司; 酶標儀(450 nm)購自美國伯騰儀器公司，兔低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)酶聯免疫分析試劑盒均購自上海江萊生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備及分組 隨機分成2組，每組各10只。A組行頸總動脈內膜空氣干燥法： 麻醉后(質量分數10%水合氯醛, 3～3.5 mL/kg)備皮、消毒, 頸部正中切口切開，充分暴露左側頸總動脈。動脈夾夾閉血管近心端及遠心端。4號頭皮針沿血管長軸刺穿，生理鹽水沖管后通氣(120 mL/min) 5 min，隨后再次往管腔內注入生理鹽水，松開動脈夾，按壓止血。待出血停止后，縫合皮膚。B組行頸總動脈外膜套環法： 準備工作如前，充分暴露左側頸總動脈，將內徑1.0 mm的薄壁硅橡膠管套住頸總動脈外膜，硅膠管均長5 mm。硅橡膠開口處使用粘合劑封閉。術后高脂飼料喂養12周。

1.3.2 觀測指標 ①ELISA法測量血漿TC、TG及LDL： 術后高脂飼料喂養0周、4周及8周, 分別經耳中動脈用EDTA真空抗凝管取血2 mL, 1 118 ×g離心5 min，取血漿棄紅細胞，再6 440 ×g離心3min，取上清-80℃保存。待血樣收集完畢按ELISA試劑盒說明書操作。②兔頸動脈超聲檢查：術后高脂飼料喂養4周、8周及12周，分別使用GE vivid E9超聲診斷儀檢查2組兔頸動脈。兔備皮后仰臥位固定于實驗臺，沿著氣管兩側找到頸總動脈，探頭選用9L，頻率8～10 MHz，調節至圖像清晰，先長軸再短軸，自上而下地檢查頸總動脈，觀測頸總動脈內膜、管徑及斑塊形態。③兔頸總動脈病理學觀察： 實驗結束時，空氣栓塞法處死全部動物。取有斑塊的頸總動脈段，送醫院病理科行HE染色后做病理學觀察。

表1 兔血清TG、TC、LDL的濃度 mmol·L-1

1.4 統計學分析

應用 SPSS23.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以s表示，同一組高脂飼料前后的血脂水平比較采用配對t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血脂水平

高脂飲食4周后血清TG、TC、LDL的濃度升高(P＜0.05)，并持續升高。而同一時間A組與B組間上述指標未見明顯差別(P＞0.05)(表1)。

2.2 超聲檢測頸總動脈

A、B組白兔頸總動脈內中膜在8周左右明顯增厚，且B組頸總動脈狹窄處內中膜增厚較明顯，血流速度也較快(表2、表3)。4周時兩組實驗兔管壁均未見明顯斑塊，管腔內血流信號充盈良好。而8周時硅膠環組部分實驗兔頸總動脈內可見小斑塊突向管腔，彩色多譜勒血流圖(CDFI)可見斑塊處血流繞行，未見明顯狹窄(圖1)。12周時，兩組實驗兔頸總動脈內均見斑塊回聲。

2.3 病理學檢查

12周時A、B兩組兔未手術側頸動脈僅可見內膜不規則增厚, 內皮細胞連續性尚好(圖2A和圖2B)。而手術側可見內皮細胞形態不規整, 伴有不同程度的連續性中斷, 病灶內膜下見泡沫細胞, 表層纖維帽結構斷裂, 彈力纖維破壞變薄, 平滑肌細胞向內膜增生,可見斑塊突向管腔(圖2C、圖2E), 且B組(圖2C、圖2D)病變較A組(圖2C、圖2E)更為明顯。

表3 套環法兔頸總動脈超聲檢測

圖1 二維超聲兔頸動脈斑塊

圖2 兔頸動脈病理學觀察

3 討論

高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化的始動因素，實驗中兔在高脂高膽固醇飲食后，4周即可測得血TG、TC和LDL濃度升高，并隨時間推移持續升高。但是單純高脂喂養建模有一定的局限性，比如動脈粥樣硬化斑塊出現位置不可控，其次兔的動脈粥樣硬化斑塊主要為纖維增生性病變為穩定性斑塊，不似人類的易損斑塊[5]。

LeVeen等[6]在1982年首次采用通入干燥氣體直接損傷血管內壁, 結合高脂飲食, 制備兔股動脈粥樣硬化斑塊模型。此方法對頸總動脈損傷僅局限于內膜，不會影響中膜，雖然內皮細胞修復與內膜增殖的過程更加接近頸動脈疾病的生理過程，但是影響因素較單一[7]。1997 年，Booth等[8-10]報道在高脂血癥兔的頸動脈外膜植入硅橡膠圈(套環法)，以得到頸動脈斑塊模型，套入硅橡膠一方面人為造成頸總動脈狹窄, 改變局部血流動力學, 另一方面硅橡膠套的機械刺激可引發血管局部炎性反應，促進動脈班塊形成。故套環法可以縮短頸動脈斑塊建模時間。本研究超聲結果顯示，同樣飼養條件下，A、B兩組兔中未受人為破壞側的動脈，內中膜變化出現時間晚，亦未見斑塊形成。兩組手術側頸總動脈均在喂養4周見內中膜增厚(表2和表3)并在8周和12周時可陸續掃查到頸總動脈斑塊。B組手術側頸總動脈斑塊形成較A組早，多數在8周即可發現凸向管腔的斑塊回聲。術后12周B組存活5只兔(存活率50%)，其中3只檢出頸動脈斑塊，且斑塊多發生在狹窄處近心端頸動脈段。A組存活4只兔(存活率40%)，僅2只建模成功。

病理學觀察也證實了超聲檢查結果。當頸總動脈出現斑塊時, HE染色光學顯微鏡下見動脈內膜形態不規整、不連續, 內彈力膜中斷, 顯示不清, 平滑肌細胞向內膜增生, 可見斑塊凸向管腔。

在實驗過程中我們發現，術后1周B組兔存活率為90%, A組兔存活率為70%，實驗結束時B組存活率50%，而A組為40%。這可能與A組手術時間較長，術中血流阻斷時間過長有關，或許可以推測套環法較空氣干燥法安全簡便。