用吖啶橙-流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)間苯二胺、對(duì)苯二胺誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞微核率

陳秀娟, 江 漪, 李 敏, 李培寧, 孫 俠, 陳梓靈, 丘智峰, 黃宇鋒

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院, 廣州 511447)

微核(Micronucleus)也叫衛(wèi)星核，是真核類(lèi)生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，是染色體畸變?cè)陂g期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。應(yīng)用小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn) (Micronucleus test)是一種能獲得大量客觀數(shù)據(jù)的遺傳毒性試驗(yàn)方法之一，該方法簡(jiǎn)便、易行、經(jīng)濟(jì), 因而被廣泛采用, 但傳統(tǒng)的微核計(jì)數(shù)是實(shí)驗(yàn)人員借助顯微鏡完成的, 方法枯燥、耗時(shí), 易受實(shí)驗(yàn)者主觀因素影響, 而且 Giemsa染色法特異性較差, 非特異著色顆粒有時(shí)很難與微核相區(qū)別，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷。近年來(lái)流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、制藥學(xué)和微生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[1-4], 本文參照有關(guān)文獻(xiàn)[5-7], 利用小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)吖啶橙(acridine orange, AO)熒光染色, 采用單激光流式細(xì)胞儀(flow cytometer, FCM)檢測(cè)骨髓細(xì)胞中含微核的嗜多染紅細(xì)胞(micronucleated polychromatic erythrocytes)和含微核的成熟紅細(xì)胞(micronucleated normochromatic erythrocytes)，通過(guò)與傳統(tǒng) Giemsa人工顯微鏡檢測(cè)法(Giemsa人工法)比較，建立AO-FCM自動(dòng)化微核試驗(yàn)，探討FCM在化妝品原料致突變性檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí) 雌性KM小鼠50只, 體質(zhì)量 20～25 g，由山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供[SCXK(魯) 2014-0007]。飼養(yǎng)于本單位屏障環(huán)境動(dòng)物設(shè)施[SYXK(粵)2014-0137]。實(shí)驗(yàn)小鼠檢疫合格后隨機(jī)分組，每組5只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有動(dòng)物在同等條件下飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。

1.2 試劑與儀器

間苯二胺(MPD)、對(duì)苯二胺(PPD)[3]均購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司, 其中PPD規(guī)格： 100 g/瓶，純度＞99%，批號(hào)： H1829001, MPD規(guī)格： 100 g/瓶，純度＞99.0%，批號(hào)： J1815296。環(huán)磷酰胺 (CP) 和(AO 均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司; TritonX-100購(gòu)自美國(guó) Sigma公司; 小牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司; 0.9%氯化鈉溶液(NS)購(gòu)自山東化魯制藥有限公司; 其余均為國(guó)產(chǎn)市售分析純?cè)噭?/p>

CytoFLEX FCM購(gòu)自美國(guó) Beckman 公司; Axio Lab A1 顯微鏡購(gòu)自德國(guó)蔡司公司; KDC-1044 低速大容量離心機(jī)購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試劑配制

固定液： 十二烷基硫酸鈉(SDS) 3 mg + 0.05 mol/L,pH 6.8 Sorensen's 緩沖液 99 mL + 戊二醛 1 mL。

溶液A： Triton X-100 0.05 mL + 1.0 mol/L HCl 4.0 mL+ NaCl 0.4385 g，加水至 50.0 mL。

溶液B： 0.1 mol/L 檸檬酸溶液 37 mL + 0.2 mol/L Na2HPO4溶液 63 mL + NaCl 0.877 g + EDTA-Na20.034 g + 1 mg/mL AO 0.6 mL。

1.4 藥物處理

受試物劑量組分別以25.0 mg/kg、12.5 mg/kg、6.25 mg/kg和3.12 mg/kg劑量[7]腹腔注射MPD或PPD。陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射40 mg/kg 的CP, 陰性對(duì)照組給予同等容量生理鹽水(NS)。注射量均為10 mL/kg, 24 h后以同樣的劑量進(jìn)行第2次染毒。

1.5 AO-FCM法

于末次染毒 6 h 后處死小鼠，分離雙側(cè)股骨，用注射器吸取400 mL 小牛血清將骨髓沖出，反復(fù)沖洗吹打，制成細(xì)胞懸液。取2.5 mL 固定液于離心管中，在振蕩混懸儀下邊振蕩邊加入100 mL細(xì)胞懸液，固定5 min，1 250 r/min 離心5 min，去上清，細(xì)胞沉淀重新混懸于100 mL 0.06 mol/L、pH 7.2的 Sorensen's 緩沖液中。溶液A與溶液B在使用前置于0 ℃冰箱放置2 h，使溶液保持低溫，加入 200 mL 溶液A與 800 mL 溶液 B，混勻，置于冰上避光染色 30 min。1 250 r/min 離心 5 min，去上清，細(xì)胞沉淀重新混懸于2.5 mL 0.06 mol/L、pH 7.2 Sorensen's 緩沖液中，用FCM進(jìn)行測(cè)定。

FCM 的主要參數(shù)： 前置角(0°)散射光(FSC)，側(cè)向角(90°)散射光(SSC)。DNA 熒光(FL1，綠色,525 nm)，刻度設(shè)置為對(duì)數(shù); RNA熒光(L4，紅色，675 nm), 刻度設(shè)置為線性。采集速度控制在1 500± 500個(gè)細(xì)胞/秒。每個(gè)樣本采集200 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。利用 FCM自帶軟件CytExpert 2.2 的分區(qū)功能, 去除有核細(xì)胞(Nucleated cells, NC), 把 PCE、MNPCE、成熟紅細(xì)胞(NCE)、MNNCE 劃分為4個(gè)區(qū), 計(jì)算骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率(fNMPCE)、骨髓成熟紅細(xì)胞微核率 (fMNNCE)、PCE/NCE。

1.6 Giemsa 人工法

對(duì)傳統(tǒng)的 Giemsa 染色法進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)： 把上述剩余的骨髓細(xì)胞懸液以 1 000 r/min 離心 5 min，去上清，細(xì)胞沉淀重新混懸于40 mL 血清中，取15 mL 制成骨髓細(xì)胞涂片, 涼干后, 甲醇固定 15 min,以 pH 6.8 Sorensen's 緩沖液配成濃度為 10% 的Giemsa染液，常溫下染色 40 min，用純凈水沖洗，再用 0.004 % 檸檬酸潤(rùn)洗數(shù)秒后, 馬上用純凈水沖洗，涼干，用環(huán)保封片劑進(jìn)行封片，鏡檢。每只小鼠分別記數(shù) 1000個(gè)PCE，計(jì)數(shù)MNPCE，計(jì)算 fMNPCE ，以千分率表示。同時(shí)計(jì)數(shù) 200個(gè)PCE時(shí)所見(jiàn)的NCE數(shù)，計(jì)算 PCE/NCE。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 AO-FCM 法檢測(cè)小鼠骨髓 fMNPCE、fMNNCE、PCE/NCE

用FCM前置角散射光(Forward angle scatter，F(xiàn)SC) 和 DNA 熒光(DNA fluorescence，F(xiàn)L1) 作二維散點(diǎn)圖，可以明顯看到細(xì)胞樣本區(qū)分為5 個(gè)群：NC(P1)、PCE(P2)、MNPCE(P3)、NCE(P4)、MNNCE(P5)。NC與紅細(xì)胞分界清楚，PCE與NCE分界也較為清楚，PCE與MNPCE、NCE與MNNCE的分區(qū)有明顯的分界趨勢(shì)。與陰性對(duì)照組比較，CP處理組的有核細(xì)胞密度下降，MNPCE及MNNCE 區(qū)域的細(xì)胞密度明顯增加，而陰性對(duì)照組的MNPCE及MNNCE所在區(qū)域未見(jiàn)明顯的細(xì)胞群。CP處理組與陰性對(duì)照組比較，fMNPCE、fMNNCE升高有顯著性差異 (P＜0.01)。MPD和PPD各劑量的 MNPCE 及 MNNCE 區(qū)域的細(xì)胞密度明顯增加，而且細(xì)胞密度隨著濃度的加大而增加，有劑量-反應(yīng)關(guān)系(圖1)。且MPD和PPD各劑量的 fMNPCE、fMNNCE與陰性對(duì)照組比較有顯著升高(P＜0.01)。PCE/NCE＞1.0，顯示MPD和PPD未對(duì)小鼠骨髓有抑制作用(PCE/NCE＞1.0)(表1)。

2.2 Giemsa人工法 檢測(cè)小鼠骨髓 fMNPCE、fMNNCE

細(xì)胞涂片 Giemsa 染色后，經(jīng) 0.004 % 檸檬酸潤(rùn)洗數(shù)秒，在顯微鏡下觀察，PCE為灰藍(lán)色，NCE呈淡黃或橘黃等鮮艷明亮的顏色，MN呈圓形或橢圓形，邊緣光滑整齊，呈紫紅色或藍(lán)紫色。玻片的背景清楚，PCE與 NCE有明顯的顏色差別，易于辨認(rèn)。MPD和PPD各劑量的 fMNPCEE、fMNNCE 有明顯有升高，與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。PCE/NCE＞1.0，顯示MPD和PPD未對(duì)小鼠骨髓有抑制作用(表2)。

2.3 AO-FCM 法與 Giemsa 人工法檢測(cè)小鼠骨髓微核結(jié)果的比較

分析比較兩種方法的fMNPCE, 無(wú)論是AO-FCM法還是 Giemsa人工法均顯示MPD、PPD誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的升高, 結(jié)果一致。AO-FCM法檢測(cè)結(jié)果略高于Giemsa人工法檢測(cè)結(jié)果，但經(jīng)SPSS 22 .0分析顯示，二者間具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為r =0.956, P＜0.01[10]。

表1 用 AO-FCM 法檢測(cè)小鼠骨髓的 fMNPCE、fMNNCE、PCE/NCE

圖1 小鼠骨髓細(xì)胞群在FCM檢測(cè)窗口的分布圖

表2 用 Giemsa 人工法檢測(cè)小鼠的骨髓 fMNPCE, PCE/NCE

3 討論

苯胺類(lèi)物質(zhì)作為氧化型染發(fā)劑中最常見(jiàn)的染料，其中常用的MPD和PPD 均會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害[10-12]，是國(guó)際公認(rèn)的一種致癌物質(zhì)[13]。

隨著FCM檢測(cè)技術(shù)的完善，流式細(xì)胞術(shù)在微核試驗(yàn)的檢測(cè)方面有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，目前已建立了大鼠、小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的FCM檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)在以往文獻(xiàn)報(bào)道的研究基礎(chǔ)上，用AO染色，采用單激光FCM檢測(cè)了小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率，探討此方法用于化妝品原料的遺傳毒性篩選和遺傳毒性評(píng)價(jià)的可能性。經(jīng) AO染色，PCE含RNA被染成橘紅色，含DNA的細(xì)胞核及微核被染成黃綠色，而 NCE不含DNA也不含RNA，不被染色，所以顯示為暗影。理論上，可利用FL1(黃綠色熒光，指示 DNA)或者 FL4 (紅色熒光，指示RNA)區(qū)分PCE與NCE。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)L4不能把PCE與NCE區(qū)分開(kāi)，而FL1 則能很好地對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，但 FL1不能把含微核的細(xì)胞與不含微核的細(xì)胞區(qū)分出來(lái)，本實(shí)驗(yàn)利用FL1 結(jié)合 FSC (指示細(xì)胞大小)，則能把細(xì)胞樣本區(qū)分為5個(gè)群： NC、PCE、MNPCE、NCE、MNNCE。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： FCM在檢測(cè)fMNPCE的同時(shí)可檢測(cè)fMNNCE，從FCM檢測(cè)窗口的分布圖可見(jiàn) MNNCE 區(qū)域的細(xì)胞密度，隨著劑量升高也有不同程度的增加，且有劑量-反應(yīng)關(guān)系。fMNNCE是否也可能作為監(jiān)測(cè)遺傳損害的生物學(xué)指標(biāo)之一呢？非常值得今后更進(jìn)一步深入研究。

本實(shí)驗(yàn)采用AO-FCM法檢測(cè)出的小鼠骨髓fMNPCE稍高于 Giemsa 染色人工顯微鏡檢測(cè)值。初步分析原因如下： ①可能是個(gè)別紅細(xì)胞產(chǎn)生了較強(qiáng)的自發(fā)熒光，造成結(jié)果偏高; ②可能是部分體積較大的PCE被誤認(rèn)為含微核的PCE，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn); ③可能是 Giemsa人工法只計(jì)數(shù)1 000個(gè)PCE，樣本量少而容易出現(xiàn)漏判，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。雖然用AO-FCM檢測(cè)存在有假陽(yáng)性的可能，但流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)是幾十萬(wàn)個(gè)甚至是更多的細(xì)胞，Giemsa人工法一般只是計(jì)數(shù)1000至2000個(gè)PCE，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量巨大，對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果的影響仍是有限的。Giemsa人工法中，實(shí)驗(yàn)人員在顯微鏡中依靠細(xì)胞顯示的染色判別 PCE、NCE、MNPCE和MNNCE，理論上PCE呈灰藍(lán)色，NCE呈桔紅色，MN呈紫紅色，但是 Giemsa 復(fù)合染料中往往含有嗜天青顆粒，很難與MN區(qū)別，而且 PCE與 NCE細(xì)胞之間并沒(méi)有明顯的區(qū)分界限，顯微鏡下仍難以將兩者完全區(qū)分; 同時(shí)不同的實(shí)驗(yàn)人員或不同的實(shí)驗(yàn)室之間并無(wú)一致的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，這些因素都會(huì)影響結(jié)果的判斷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 AO-FCM自動(dòng)化微核檢測(cè)體系可替代人工顯微鏡，用于小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的檢測(cè)。