礦區廢棄地植物重金屬抗性內生真菌的篩選及ITS序列分析

曾松榮，吳景婷，張翠瓊，柯 野，鄭秋樺

（韶關學院 英東生命科學學院，廣東 韶關 512005）

尾礦庫、廢石堆等礦業廢棄地生態修復的關鍵是植被恢復，因為植被恢復能夠增加地表穩定性，控制重金屬和水土流失，改善土壤的營養狀況，改善礦區景觀，因而具有良好的環境、生態、社會和經濟等多方面的綜合效益.然而尾礦庫等礦業廢棄地因為眾多的理化因素，包括重金屬毒性、極端的酸堿度、養分缺乏等，都會限制植物在廢棄地上定居和生長，因此植被的自然恢復非常緩慢，必須對其采取積極的人工恢復措施加以干預，才能對土壤的重金屬污染進行有效治理［1］.本研究以粵北凡口鉛鋅礦廢棄地的尾庫礦及廢石堆中優勢植物的內生真菌作為研究對象，篩選出Pb、Zn抗性較高的內生真菌優勢菌株，并通過對抗性菌株的形態學鑒定和ITS序列分析，確定抗性菌株的種屬關系，為進一步對這些重金屬抗性菌株進行促生作用篩選和盆栽促生試驗奠定基礎，也為探索內生真菌提高宿主植物重金屬耐受性，以及對宿主植物的促生作用的機理和礦區廢棄地的植被恢復，防止礦區廢棄地水土流失、減輕重金屬對周圍環境造成的污染等工作提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

采集粵北凡口鉛鋅礦廢棄地尾庫礦及廢石堆的類蘆（Neyraudia reynaudiana），艾草（Artemisia vulgaris），苦楝（Melia azedarach），苧麻（Boehmeria nivea），青葙（Celosia argentea），醉魚草（Buddleja lindleyana）等 6 種優勢植物帶回實驗室作為內生真菌分離的實驗材料.

1.1.2 培養基

（1）PDA（Potato Dextrose Agar）培養基：馬鈴薯 200 g，瓊脂粉 15～20 g，蔗糖 20 g，水 1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min.（分離培養基需加入鏈霉素以抑制細菌生長）.

（2）PDB（Potato Dextrose Broth）培養基：PDA培養基中不添加凝固劑瓊脂粉.

（3）含氨芐的 LB（Luria-Bertani）培養基：氯化鈉 10 g，蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，瓊脂粉 15～20 g，水 1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，滅菌結束后，待LB培養基溫度降至不燙手背時，以1 mL LB培養基加入1μL氨芐青霉素的比例加入，充分混勻，氨芐青霉素的濃度為100 mg/mL.

（4）查氏（Czapek）培養基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.1.3 藥品及試劑

UNIQ柱式真菌基因組抽提試劑盒、SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒、DNA CLONING VECTOR KIT（PMD19-T）、PCR 擴增試劑盒（Prime STAR Max）、PCR 擴增試劑盒（rTaq）、SanPrep 柱式質粒 DNA 小量抽提試劑盒、通用引物 ITS1(5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司.硫酸鋅、硝酸鉛等化學試劑均為分析純，產自天津大茂市化學試劑廠.

1.2 方法

1.2.1 植物內生真菌的分離

選取健康新鮮的優勢植物的根部組織作為實驗材料，用流水洗凈后，瀝干水分，剪成約2 cm長的小段，在超凈工作臺中置于75%的酒精中浸泡2 min后，再將根段置于0.1%的氯化汞溶液中浸泡5 min，無菌水沖洗3～5次，并分別保留最后一次沖洗的無菌水涂布平板以檢驗其根段表面是否殺菌徹底［2］.

用無菌濾紙吸干水分，無菌解剖剪刀剪去根段兩頭，余下約1 cm的小段，分別按壓于含重金屬離子鉛或鋅的PDA平板上，25℃恒溫培養箱中培養3～7 d，即可觀察到根段樣品剪切過的邊緣有霉菌菌絲長出，絲狀霉菌經純化后轉接到PDA斜面上培養好后置4℃冰箱保存備用.

1.2.2 重金屬抗性菌株篩選

（1）將4℃冰箱保藏的六種優勢植物內生真菌分別接到PDA平板上活化后，挑取其菌絲用于Pb、Zn重金屬抗性菌株的篩選.使用PDB培養基，參照《土壤環境質量標準》（GB15618-1995）［3］設置培養基中Pb2+、Zn2+的濃度均為750 mg/L.在250 mL的三角瓶中裝入25 mL配制好的鉛或鋅離子濃度的PDB培養基，分別接入植物內生真菌菌株.并做好重金屬離子的空白對照.置于搖床上28℃、150 rpm，培養7 d.搖瓶結束后，4 000 r/min離心20 min，收集菌體，稱其濕重.然后將稱過濕重后的菌體放入培養皿中置于60℃烘箱中，直至恒重狀態，稱其干重.

（2）重金屬耐受指數的測定

重金屬耐受指數（TI）通過真菌生物量的干重來計算，公式：

耐受指數=（處理組菌絲干重/對照組菌絲干重）×100（%）［4］，

以TI≥50%表示受試菌株對Pb2+或Zn2+具有抗性，反之無抗性［5］.

1.2.3 重金屬抗性菌株的形態學鑒定

將抗性菌株在查氏培養基培養3～5 d，分別觀察它們的菌落形態特征及光學顯微鏡下的個體形態特征進行初步鑒定［6-9］.

1.2.4 重金屬抗性菌株的ITS序列分析

（1）內生真菌基因組的提取

將活化后的菌株轉接于裝有25 mL PDB培養基的250 mL三角瓶中28℃、150 rpm搖瓶培養，培養3～5 d.待菌絲球生長到一定的量后，用過濾的方法收集菌絲體，置于已滅菌的陶瓷研缽中，加入液氮將真菌菌絲研磨成粉末［10］，然后按照UNIQ-10柱式真菌基因組抽提試劑盒說明書提取獲取菌株基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，置于-20℃保存或直接用于后續試驗.

（2）ITS序列 PCR 擴增

使用Prime STAR Max（PCR擴增試劑盒），對提取的內生真菌基因組DNA進行ITS序列的PCR擴增，PCR 擴增，PCR 擴增體系如下：Prime STAR Mas 25 μL，DNA 模板 2 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2μL，Sterilized dd H2O 19μL，總體積 50μL.

PCR 反應條件如下：98℃預變性 3 min，98℃變性10 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 10 s，最后 72℃延伸 5 min，30個循環，16℃保溫.PCR反應結束后，電泳檢測ITS序列擴增結果后，采用SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒對PCR擴增產物進行回收.

（3）PCR回收純化產物3’末端加堿基A

由于載體pMD19-T連接的PCR產物3’末端應有堿基A，而通過高保真酶（Prime STAR Max）PCR擴增出的ITS序列是平末端，為了提高連接效率，需先在擴增產物的3’末端加堿基A.將PCR產物全部轉移到PCR管中，加入等體積的rTaq酶混合均勻，PCR反應條件如下：72℃ 5 min，72℃45 min，16℃保溫.

對加堿基A的PCR產物進行回收，回收過程與PCR擴增產物的回收純化相同.回收的產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR加堿基A產物回收的結果.

（4）ITS序列體外重組及轉化

使用DNA CLONING VECTOR KIT載體試劑盒，將目的基因與載體pMD19-T連接.采用氯化鈣法制備大腸桿菌DH5α感受態細胞，并將重組質粒轉入感受態細胞.培養后，均勻涂布含氨芐青霉素的LB平板，培養15～20 h，從長出菌落的平板上各挑取多個單菌落分別接種至500μL含有氨芐青霉素的LB液體培養基中進行培養［11］.

（5）陽性克隆的篩選

通過菌液PCR技術驗證是否為陽性克隆菌.使用M13引物，上下游引物各0.8μL；rTaq酶10μL；菌液1.6μL；加入 ddH2O 6.8μL 補足，制成 20 μL 的反應體系.PCR 反應條件為：94℃ 3 min，94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 2min，30 個循環，72℃ 5 min，16℃保溫.

電泳檢測菌液PCR的結果后，將陽性克隆菌進行擴大培養：每25 mL的LB培養基中加入25μL氨芐青霉素和200μL菌液，120 rpm，37℃搖甁培養12～16 h后做成凍存管送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序.

（6）序列測定和系統發育樹的構建

采用雙向測序法.測序結果為2條序列，互補部分可用DNAMAN進行拼接，通過BioEdit軟件查找上下游引物的位置，并切除引物以外的序列，得到所需的ITS序列.將得到的ITS序列在NCBI數據庫中進行BLAST，選取若干個與該序列同源性較高的序列，利用MEGA 7.0軟件的鄰位法（Neighbor-Joining Method）構建系統發育樹，進一步確定重金屬抗性菌株的種屬關系［12］.

2 結果與分析

2.1 內生真菌的分離

挑取PDA平板中六種植物根部組織塊周圍的霉菌菌絲，在PDA平板上三點接種進行分離純化.共得到92株內生真菌，轉接到斜面4℃冰箱保存.由最后一次清洗植物根段的無菌水涂布PDA平板作為對照，沒有菌落生長，說明植物根段表面已經殺菌徹底，分離得到的真菌都是根部內生真菌.

2.2 抗重金屬內生真菌的篩選結果

從6種植物中篩選得到的抗重金屬離子Pb2+與Zn2+能力強的菌株，如表1所示.

表1 六種優勢植物內生真菌在一定Zn2+和Pb2+濃度下的TI值

結果顯示，篩選得到重金屬抗性菌株共有19株，其中艾草4株、苦楝6株、苧麻1株、青葙4株、醉魚草4株、類蘆0株，并且有部分菌株TI＞100%，這些菌株在重金屬環境下比沒有重金屬的環境下生長更加好.表明一些土著真菌在長期持續的土壤重金屬這種非生物脅迫環境中對重金屬有了明顯的適應，有毒的金屬甚至有可能被這些抗性菌株作為微量營養元素.因此，把這些對重金屬脅迫適應的真菌接種到植物，對重金屬污染土壤的植物修復是有益的［13］.

2.3 重金屬抗性菌株的鑒定結果

2.3.1 重金屬抗性菌株的形態學鑒定

圖1 部分內生真菌的菌落形態

部分重金屬抗性菌株在查氏培養基中的菌落形態，如圖1所示.依據絲狀真菌的菌落形態和菌體的個體形態特征，對重金屬抗性菌株進行初步鑒定，見表2.

表2 重金屬抗性菌株的形態鑒定結果

鑒定結果表明，分離純化的19株重金屬抗性菌株中的15株分別屬于曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀霉屬（Fusarium）、木霉屬（Trichoderma），WB-3、QXG-13、ZYC-11 和 ZYC-17 等 4 個菌株因孢子或子實體的結構特征不明顯，無法用形態學鑒定.

2.3.2 重金屬抗性菌株的分子生物學鑒定

霉菌的ITS序列的PCR產物與克隆載體16℃連接過夜，導入感受態細胞大腸桿菌DH5α中，培養后涂布含100μg/mL Amp的LB平板，生長情況良好，見圖3.將挑選的單菌落至500μL含Amp(100μg/mL)的LB液體培養基中，搖床培養8～10 h.再進行菌液PCR驗證，得到約750 bp的目的條帶，見圖4.

圖3 重組受體菌在含Amp的LB上生長

圖4部分抗性菌株基因組PCR產物電泳圖

2.4 抗性菌株的ITS測序結果和構建系統發育樹

將測序得到的ITS序列在NCBI數據庫中進行BLAST對比，19株真菌ITS序列同源性如表3所示.

表3 19株內生真菌的ITS序列同源性

選取多個與測序得到的ITS序列同源性較高的序列，利用MEGA 7.0軟件的鄰位法（Neighbor-Joining Method）構建系統發育樹［14］.結果如圖 5所示，圖中分支上的數字表示樹形置信度，括號內為NCBI數據庫登錄號.

ITS序列分析結果表明，19株重金屬抗性菌株分屬于曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀霉屬（Fusarium）、籃狀菌屬（Talaromyces）、微皮傘 屬 （Marasmiellus）、木霉屬 （Trichoderma）等5個屬，其中15個菌株已被鑒定到種，QXG-12、ZYC-11、ZYC-17 和 QXG-13等4個菌株只能暫定到屬，它們的種名有待進一步鑒定.

圖5 基于ITS序列構建內生真菌系統發育進化樹

3 結論

從礦區廢棄地艾草、苦楝、苧麻、青葙、醉魚草、類蘆等六種優勢植物的根部組織分離到92株內生真菌，從中篩選出抗重金屬離子Pb2+與Zn2+能力較強內生真菌19株，分別屬于5個屬，其中15個菌株已鑒定到種，另有4個菌株暫定到屬，并有1株QXG-13為國內甚少報道的隸屬于擔子菌的微皮傘屬（Marasmiellus）［15］.說明重金屬抗性菌株中除了一些小型的絲狀霉菌外，也存在具有大型子實體的擔子菌.研究結果表明，礦區廢棄地植物重金屬抗性內生真菌中除了一些小型的絲狀霉菌外，也存在具有大型子實體的擔子菌，并顯示重金屬抗性菌株具有一定的多樣性.

絲狀霉菌的傳統鑒定方法往往是以其形態學特征為基礎，但基于形態學表型特征的鑒定則容易出現誤判，因此對操作者的經驗和熟練程度要求較高.有些絲狀霉菌為不產孢子的無孢類群，缺乏孢子和子實體等結構的分類特征，因此種屬鑒定就更加困難.本研究先采用霉菌的形態學進行初步鑒定，然后在此基礎上進行ITS序列分析，將所得序列進行Blast同源比對，為內生真菌的菌種鑒定提供更進一步的科學依據［16-17］.