HPLC法測定降糖益腎丸中毛蕊花糖苷的含量

謝 瑜，雷 昌，王 青*，梁曉嵐，鄒菊英

(1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫藥大學/湖南省中藥粉 體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

降糖益腎丸為湖南中醫藥大學第二附屬醫院用于治療糖尿病腎病的常用院內自制中藥，該藥控制糖尿病腎病早期癥狀療效確切，在多年臨床應用中無明顯不良反應，安全可靠。降糖益腎丸由生地、山藥、益母草、黃芩等多味中藥組成，具有益氣養陰、活血化瘀、瀉火解毒的功效[1]。方中生地為君藥，現代化學和藥理學研究表明，生地藥材的化學成分主要包括環烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、紫羅蘭酮類、糖類等，其中苯乙醇苷類代表性化合物毛蕊花糖苷，具有抗氧化、腎功能保護、免疫調節、抗細胞凋亡等作用[2-3]。

目前降糖益腎丸質量標準僅采用薄層色譜法對部分藥味進行鑒別，專屬性較低，缺少方中有效成分的含量控制。為了控制降糖益腎丸的質量，確保用藥安全有效，亟需提高該藥的質量標準。因此，本研究以毛蕊花糖苷為檢測指標，采用HPLC法對其進行含量測定，以期進一步完善降糖益腎丸的質量標準。

1 儀器與材料

Agilent 1260 LC(安捷倫科技有限公司)；Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；電子分析天平T-214(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

降糖益腎丸由湖南中醫藥大學第二附屬醫院制劑室生產提供(批號：20170901、20170912、20170924)。毛蕊花糖苷對照品(批號：111530-201713)購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純，實驗用水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品適量，置100 mL量瓶中，加無水甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后制成每1 mL中含毛蕊花糖苷30.4 μg的對照品溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取其續濾液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品細粉約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇100 mL，50 ℃溫浸2 h，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)提取30 min，濾過，減壓回收提取液至干，殘渣加無水甲醇溶解并轉移至10 mL量瓶中，定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 除去生地的降糖益腎丸處方飲片，按處方比例和工藝要求制成缺生地的降糖益腎丸陰性樣品，再按上述供試品溶液制備項下的方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；檢測波長為280 nm；流動相：A為乙腈，B為0.2%磷酸溶液，按表1中的規定進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫條件

按照擬定的色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定并記錄色譜圖。結果表明，供試品色譜圖在與對照品色譜圖相應保留時間處，有一相同的色譜峰，而陰性樣品溶液未見該峰，表示無陰性干擾成分。供試品色譜峰的分離度、拖尾因子、理論板數均能達到系統適應性要求，結果見圖1。

2.3 毛蕊花糖苷的線性關系考察

按照擬定的色譜條件，精密吸取上述“2.1”項下的毛蕊花糖苷對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL進樣，測定峰面積，以對照品進樣量X為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，求得其回歸方程為：Y=0.879 7X+4.079 8，r=0.999 7，表明毛蕊花糖苷在60.8～364.8 ng質量范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

A.毛蕊花糖苷對照品；B.降糖益腎丸供試品；C.降糖益腎丸陰性樣品

圖1 降糖益腎丸中毛蕊花糖苷的HPLC色譜

2.4 精密度試驗

精密吸取“2.1”項下的同一批號(20170912)降糖益腎丸供試品溶液，在上述HPLC條件下，連續進樣6次，記錄毛蕊花糖苷峰面積，計算求得其RSD值為0.92%。結果表明，該方法的精密度良好。

2.5 穩定性試驗

精密吸取同一批號降糖益腎丸供試品溶液，在上述色譜條件下，常溫時分別于制備后0、2、4、8、12、24h依次進樣測定，記錄毛蕊花糖苷的峰面積值，計算其RSD值為0.92%。結果表明，降糖益腎丸樣品溶液在24 h內穩定性良好。

2.6 重復性試驗

稱取降糖益腎丸同一批樣品(批號：20170912)約10 g，共6份，精密稱定，按上述“2.1”項下方法制成供試品溶液，在所確定的色譜條件下分別測定毛蕊花糖苷的含量，計算其平均含量為0.039 0 mg/g，RSD為0.95%，結果表明，該測定方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的降糖益腎丸細粉(批號：20170912，毛蕊花糖苷含量為0.039 0 mg/g)約10 g，精密稱定6份，分別精密加入30.4 μg/mL毛蕊花糖苷對照品溶液10 mL(相當于0.304 mg)，按上述“2.1”項下方法制成供試品溶液進樣測定，計算毛蕊花糖苷含量、回收率和RSD值，結果平均回收率為97.56%，RSD為1.04%。見表2。

2.8 樣品含量測定

取3批降糖益腎丸樣品(批號：20170901，20170912，20170924)按照上述“2.1”項下的方法制備成樣品溶液。在所確定的色譜條件下，測定毛蕊花糖苷含量，測得3批降糖益腎丸樣品中毛蕊花糖苷含量分別為0.039 0 mg/g、0.038 9 mg/g、0.039 9 mg/g。

3 討論

本實驗采用不同比例提取溶劑(50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇) 超聲提取，結果表明100%甲醇提取的供試品溶液進入液相后其他成分的干擾大，結果見圖2。

表2 回收率試驗結果

圖2 降糖益腎丸的HPLC色譜

采用50%甲醇溶液、75%甲醇溶液則可避開多雜質出峰，為提高提取效率，選擇75%甲醇溶液超聲提??；考慮到降糖益腎丸為全生藥粉制丸的口服固體制劑，故超聲提取前于50 ℃溫浸2 h有利于有效成分充分溶出。

目前國內外現代醫學對糖尿病腎病治療主要采取控制血糖、血壓及抗腎病對癥處理，尚無滿意的防治方法，藥物僅能改善患者相關癥狀，存在易復發、副作用大等缺點[4]。中醫理論指導下應用復方中藥治療糖尿病腎病具有作用溫和、療效持久、毒副作用小的優勢[5]，但其復雜的成分體系使得其藥效物質基礎研究困難。因此，本研究通過高效液相法測定降糖益腎丸中毛蕊花糖苷的含量，不僅為本制劑的質量標準提供依據，同時對于降糖益腎丸抗糖尿病腎病的物質基礎研究具有重要意義。