枳殼揮發油中檸檬烯含量與麩炒炮制及抑菌活性的關系

張智敏，聶 莼，李亞梅 ，彭買姣，羅 堃*，嚴建業,3*

(1.湖南中醫藥大學 藥學院，湖南 長沙410208；2.湖南中醫藥大學 湘產大宗藥材品質評價湖南省 重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學 藥學分析檢測中心，湖南 長沙410208)

枳殼(AurantiiFructus)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實[1]，為臨床最常用的理氣藥物之一，具有理氣寬中、行滯消脹的功效?，F代醫學研究表明，枳殼具有調節胃腸動力、抗抑郁、抑菌等藥理作用[2]。枳殼揮發油作為枳殼的主要成分，具有理氣、行滯、鎮咳、祛痰、抑菌等作用[3]。枳殼揮發油為單萜及其含氧衍生物[4]，其中以檸檬烯含量最高[5]，被認為是枳殼理氣作用的重要成分[4]。此外，檸檬烯還具有鎮咳、祛痰、抑菌等活性[6]。枳殼生品較峻烈[7]，中醫認為檸檬烯具有燥性，身體虛弱者服用會傷及元氣，麥麩皮能抑制枳殼酷性，令其勿傷膈，欲制其燥性，助其消導，可炒置用之[8]。本研究旨在分析麩炒炮制法對不同產地枳殼揮發油中檸檬烯含量的影響，以及枳殼揮發油的抑菌活性與其主要成分檸檬烯的關系，為枳殼揮發油的質量評價提供參考，并為深入研究枳殼藥材提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器

GC-2010型氣相色譜儀(日本島津有限公司)；1510型酶標儀(賽默飛世爾科技上海儀器有限公司)；LDZM-60KCS型高壓蒸汽滅菌鍋(上海永安醫療器械廠)；DH-400AB型電熱恒溫培養箱(成都致力儀器有限公司)；ZHWY-200D型恒溫振蕩器(上海智仁分析儀器制造有限公司)；DEN-1型麥氏比濁儀(EU for Grant Instrucments Ltd)；萬分之一分析天平(美國奧豪斯)；JK-G-522B3高速萬能粉碎機(上海精學科學儀器有限公司)；DZTW型調溫電熱套(北京市永光明醫療儀器)；揮發油提取裝置(蜀牛有限公司)；SW-CJ-2FD 型凈化工作臺(南京迅達空氣技術有限公司)。

1.2 藥材與試劑

13批枳殼藥材經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實，來源及產地見表1。二甲基亞砜(DMSO)、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇為色譜純；氨芐西林(編號：A100339-0005，生工生物工程(上海)股份有限公司)；硫酸慶大霉素碳酸鉍(山西云鵬制藥有限公司)。

表1 枳殼樣品信息

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌ATCC26003、表皮葡萄球菌、大腸桿菌ATCC44138、沙門氏菌ATCC50115均來源于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.4 培養基

營養瓊脂培養基(杭州濱河生物試劑有限公司，批號：140720)；營養肉湯培養基(杭州天和微生物試劑有限公司，批號：130730)。

2 方法與結果

2.1 枳殼炮制品制備

方法參照2015年版《中國藥典》。

2.2 枳殼揮發油提取

枳殼生品和枳殼炮制品粉碎過40目篩，分別取1 kg粉末樣品，置于10 000 mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水浸泡過夜，安裝揮發油提取裝置，參考《中國藥典》2015年版第四部通則2204揮發油測定法提取枳殼揮發油，經無水Na2SO4干燥后，封裝備用。

2.3 氣相色譜分析

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取檸檬烯標準品0.827 2 g，用色譜純甲醇定容至10 mL，配制成82.72 mg/mL的檸檬烯對照品溶液。用移液槍分別精密吸取檸檬烯(濃度為82.72 mg/mL)對照品溶液0.20、0.50、1.00、1.50、2.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用色譜純甲醇定容至刻度，搖勻，經0.22 μm濾頭過濾后，備用。

2.3.2 供試品溶液制備 分別精密吸取“2.2”項下所得揮發油 200 μL，用乙酸乙酯定容至5 mL，過0.22 μm濾膜后，冷藏備用。

2.3.3 色譜條件 色譜柱：石英毛細管柱Rtx-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；樣口溫度：250 ℃；程序升溫：50 ℃保持 5 min，然后以 10 ℃/min 升至230 ℃，保持10 min。進樣量為0.8 μL，分流比為10∶1，柱壓為100 kPa，載氣流量為18.30 mL/min。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取“2.3.1”項下不同質量濃度梯度的對照品溶液，分別注入氣相色譜儀中。以檸檬烯質量濃度(mg/mL)為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。得對照品回歸方程為Y=2E+06X-968 311，檸檬烯在 1.654～16.544 mg/mL濃度范圍內與峰面積積分線性關系良好，R2=0.995 7。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取“2.3.2”項下同一供試品溶液(S4)，在“2.3.3” 項色譜條件下連續進樣6次，測定色譜峰峰面積，各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于 3%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 精密吸取“2.3.2”項下同一供試品溶液(S4)，分別于放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時進樣，測定各主要色譜峰峰面積，各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均<2.11%，表明在24 h內供試品溶液穩定性良好。

2.3.7 重復性試驗 取S4號樣品6份，按照“2.2”項下方法提取枳殼揮發油，并按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別測定色譜峰峰面積，色譜圖中各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值均<3%，表明方法重復性良好。

2.3.8 回收率試驗 精密吸取3份S4號樣品各1 mL，分別加入檸檬烯含量為4.136 mg/mL、8.272 mg/mL、12.396 mg/mL的標準品各1 mL，混勻后每個樣品測定3次，得出平均回收率為96.96%，RSD為1.2%。

2.4 枳殼揮發油中檸檬烯含量測定

取供試品溶液按照“2.3.3”項下色譜條件進樣分析(檸檬烯對照品和枳殼揮發油樣品的氣相色譜如圖1所示)，記錄色譜峰峰面積，采用外標法，將供試品中檸檬烯的峰面積代入“2.3.4”項下回歸方程中計算其濃度，并換算成每1毫升揮發油中的檸檬烯含量。結果見表2。

A-檸檬烯對照品GC色譜；B-枳殼揮發油GC色譜(S9)；a-檸檬烯

表2 枳殼揮發油中檸檬烯含量測定結果

由表2數據可知，不同產地的枳殼揮發油中檸檬烯含量存在差異，其中湖南和江西產地枳殼的檸檬烯含量較高，而河北產地的檸檬烯含量較低?？傮w來說，經麩炒炮制后，枳殼揮發油中檸檬烯含量呈下降趨勢。據文獻[9]報道，枳殼麩炒后，其揮發油含量會降低，其中檸檬烯等低沸點組分含量有所下降，與本研究結果基本吻合。

2.5 抑菌活性檢測

2.5.1 供試品溶液制備 分別精確吸取“2.2”項下揮發油樣品1 mL，與40% DMSO等體積混合均勻，臨用前無菌濾過，即為揮發油供試品溶液。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取氨芐西林標準品粉末500 mg，用無菌水定容至5 mL，得100 mg/mL的氨芐西林標準儲備液。精密吸取儲備液200 μL，用無菌水稀釋至100 mL，得到200 μg/mL氨芐西林陽性對照品溶液。精密稱取每0.6 g含40 mg慶大霉素的硫酸慶大霉素碳酸鉍0.3 g，用無菌水稀釋至100 mL，得到200 μg/mL慶大霉素陽性對照品溶液。

2.5.3 菌懸液配制 分別將實驗用菌種接種于營養瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養24 h后，挑選特征菌落接種于營養肉湯培養基中，37 ℃搖床培養12 h后，采用麥氏比濁法用無菌生理鹽水將其稀釋至0.5麥氏比濁單位，即1.5×108CFU/mL菌懸液，備用。

2.5.4 最低抑菌濃度(MIC)測定 在無菌的96孔板A-H排每孔中各加入100 μL營養肉湯，分別吸取四種預先配制的揮發油供試品溶液各100 μL至A排1-3/4-6/7-9/10-12孔(即每塊96孔板做一種菌的4個不同供試品，每個供試品重復操作3次)，混合均勻；從A排每孔分別吸取100 μL溶液至B排相應孔，依次倍比稀釋(吸取前注意混合均勻)，H排各孔棄去100 μL溶液。同時設置氨芐西林陽性對照和慶大霉素陽性對照(以倍比稀釋的抗生素替代藥液)、無菌水陰性對照、40% DMSO陰性對照、揮發油供試品溶液空白對照(以無菌水替代菌液)、培養基空白對照(以無菌水替代藥液及菌液)。最后于每孔中各加入100 μL菌懸液(1.5×108CFU/mL)，在37 ℃下培養24 h后觀察，并于600 nm處測定吸光值A。目測抑菌液濃度最低且澄清的孔(即(A供試品-A供試品空白對照)/A培養基空白≈1)所對應的即為最小抑菌濃度(MIC)。結果見表3。

表3 枳殼揮發油MIC測定結果 (μL/mL)

由表3可以看出，枳殼揮發油對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)的抑菌效果要強于革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和沙門氏菌)，這是由于革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的細胞壁結構不同：革蘭氏陰性菌的細胞壁有一個額外的外膜組成的雙層脂多糖[10]，脂多糖分子通過排斥揮發油的疏水性成分形成屏障，阻止揮發油進入細胞壁內[11]。而革蘭氏陽性菌的細胞壁只有一層,主要由肽聚糖組成，由于缺少這種屏障，揮發油中的疏水性成分更易滲透，一些成分與細胞壁上的特定靶點結合，從而破壞細胞膜，使細胞質流出，最終導致細菌死亡[12]。但是S4、S8、S13、S17枳殼揮發油出現對沙門氏菌的抑菌活性強于金黃色葡萄球菌的現象，這可能是由于細菌上的不同細胞靶點以多種形式結合揮發油的不同成分，從而使沙門氏菌對枳殼揮發油比革蘭氏陽性菌更加敏感[13]。

此外，由表3可知，枳殼經麩炒炮制后，其揮發油的抑菌活性有所增強，該結果與文獻[14]報道的結論一致。

2.6 檸檬烯含量與抑菌活性關聯分析

采用SPSS17.0中雙變量相關分析方法，以枳殼揮發油中檸檬烯含量作為X變量，1/MIC值作為Y變量，計算兩者的Pearson相關系數。結果見表4。

表4 檸檬烯含量與抑菌活性的Pearson相關性

注：X：枳殼揮發油中檸檬烯含量；Y1：大腸桿菌的1/MIC值；Y2：沙門氏菌的1/MIC值；Y3：金黃色葡萄球菌的1/MIC值；Y4：表皮葡萄球菌的1/MIC值。

由表4可知，枳殼揮發油中檸檬烯含量與其對表皮葡萄球菌和沙門氏菌的1/MIC呈負相關，說明枳殼揮發油中檸檬烯所占比例越小，其揮發油對表皮葡萄球菌和沙門氏菌的抑制作用越強；枳殼揮發油中檸檬烯含量與其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的1/MIC呈正相關，說明枳殼揮發油中檸檬烯所占比例越大，其揮發油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用越強。

3 討論

本研究探討了麩炒炮制對枳殼揮發油中檸檬烯含量的影響，并初步分析了枳殼揮發油的抑菌活性與檸檬烯含量的關系，發現麩炒會降低枳殼檸檬烯含量。此外，枳殼揮發油中檸檬烯含量越高，其揮發油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用越強。然而，植物揮發油的抑菌效果可能是其揮發油中多種成分協同作用的結果[15]。因此，分析枳殼揮發油中其他低含量成分對枳殼揮發油抑菌活性的影響，針對枳殼揮發油抑菌活性進行全面的譜效分析以及開展驗證實驗將是下一步的研究方向。