百合配方顆粒HPLC指紋圖譜研究

姚 娜，黃燕明，陳桂生，李雪銀，康志英

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.隆德縣六盤(pán)山 中藥資源開(kāi)發(fā)有限公司， 寧夏 固原 756300)

百合配方顆粒是以百合飲片為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒、包裝等工藝制備而成。原料百合為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.、百合LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulumBaker或細(xì)葉百合LiliumpumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉，秋季采挖，洗凈，剝?nèi)△[葉，置沸水中略燙，干燥。其具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清心安神的功效，臨床上用于陰虛燥咳、勞嗽咳血、虛煩驚悸、失眠多夢(mèng)、精神恍惚[1-2]。百合是中藥的藥食同源植物，主要分布于北溫帶和亞熱帶地區(qū)。百合的鱗莖主要含有甾體皂苷、甾醇、酚酸甘油酯、黃酮、苯丙素、生物堿和多糖類(lèi)等化合物[3-5]。研究表明，百合具有止咳祛痰、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗應(yīng)激損傷、抗抑郁、降血糖及抑菌等藥理作用[6-8]。

1 儀器與試藥

萬(wàn)分之一電子分析天平(ME204，瑞士Mettler toledo公司)；超純水器(Simplicity，美國(guó)密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；Agilent1260 高效液相色譜儀(德國(guó)Agilent公司，G1311B單四元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315D檢測(cè)器、OPENLAB CDS ChemStation Edition 數(shù)據(jù)處理軟件)；Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司，LPG-3400SDN單四元泵、WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000RS柱溫箱、DAD-3000檢測(cè)器、Chromeleon7.2數(shù)據(jù)處理軟件)；色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

百合對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，121100-201304，規(guī)格：1 g)；乙腈、甲酸為色譜級(jí)；甲醇為分析純。

10批百合配方顆粒均來(lái)自廣州市香雪制藥股份有限公司(批號(hào)依次為01～10，規(guī)格為1.0 g/袋)；麥芽糊精來(lái)自湖州展望藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-11], 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長(zhǎng)為25 cm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，按表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫25 ℃；流速為0.6 mL/min。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照溶液制備

取百合對(duì)照藥材4 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液濃縮至近干，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取百合配方顆粒約1 g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理15 min(頻率40 kHz，功率250 W)，放冷，濾過(guò)，濾液濃縮至近干，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定法

分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖。

2.5 10批樣品的檢測(cè)結(jié)果

分別取10批百合配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備10份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，得到10批百合配方顆粒的色譜疊加圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.1版》對(duì)10批百合配方顆粒指紋圖譜進(jìn)行計(jì)算，相似度達(dá)0.99以上。結(jié)果見(jiàn)圖1、表2、圖2。

圖1 10批百合配方顆粒指紋圖譜疊加圖

批號(hào)01020304050607080910對(duì)照指紋圖譜011.0000.9991.0001.0001.0000.9971.0000.9990.9990.9980.999020.9991.0001.0001.0001.0000.9990.9991.0001.0001.0001.000031.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0000.9991.000041.0001.0001.0001.0001.0000.9981.0000.9991.0000.9991.000051.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0000.9991.000060.9970.9990.9990.9980.9991.0000.9971.0000.9991.0000.999071.0000.9991.0001.0001.0000.9971.0000.9990.9990.9980.999080.9991.0001.0000.9991.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000090.9991.0001.0001.0001.0000.9990.9991.0001.0001.0001.000100.9981.0000.9990.9990.9991.0000.9981.0001.0001.0001.000對(duì)照指紋圖譜0.9991.0001.0001.0001.0000.9990.9991.0001.0001.0001.000

2.6 指紋圖譜中共有峰確認(rèn)

通過(guò)對(duì)10批廣州市香雪制藥股份有限公司生產(chǎn)的百合配方顆粒進(jìn)行分析，并與百合對(duì)照藥材進(jìn)行比對(duì)，有6個(gè)色譜峰能穩(wěn)定重現(xiàn)，且峰面積占總面積的比例均大于3%，故確立了6個(gè)共有峰。其中，2號(hào)峰、6號(hào)峰的峰面積占總面積的比例均大于10%，峰純度較純，故2、6號(hào)峰為特征峰。

圖2 百合配方顆粒指紋圖譜共有模式

2.7 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.7.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取百合配方顆粒、麥芽糊精分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，6個(gè)共有色譜峰的鑒定均不受溶劑及輔料等因素干擾，具有良好的專(zhuān)屬性。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取同一批百合配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件于高效液相色譜儀上連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.1版》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，各圖譜共有峰與對(duì)照指紋圖相似度均大于0.990 0，表明該儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批百合配方顆粒樣品，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，各圖譜特征峰的相似度均大于0.990 0，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份百合配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果各圖譜共有峰的相似度均大于0.990 0，表明該供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 中間精密度試驗(yàn) 分別考察不同分析人員、不同日期、不同設(shè)備對(duì)精密度的影響，結(jié)果各圖譜共有峰的相似度均達(dá)0.9900以上，表明該方法中間精密度良好，隨機(jī)變動(dòng)因素不影響該方法精密度。

2.7.6 耐用性實(shí)驗(yàn) 取同一批百合配方顆粒供試品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，分別使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、WelchUltimateXB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種型號(hào)的色譜柱，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果在不同色譜柱因素變動(dòng)的條件下，各圖譜共有峰的相似度均達(dá)0.990 0以上，表明該方法耐用性良好。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-水等流動(dòng)相體系；柱溫分別選用20、25、30 ℃；全波長(zhǎng)掃描考察了不同波長(zhǎng)下供試品的指紋圖譜。最終選取在柱溫25 ℃下，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，以乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脫，該條件下譜圖色譜峰信息豐富，分離度好，穩(wěn)定性好。

在色譜柱的選擇中，根據(jù)百合配方顆粒樣品中的成分類(lèi)別及理化性質(zhì)，選用C18柱進(jìn)行分離，分別考察了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種型號(hào)的色譜柱，各色譜峰均能達(dá)到基本分離，各型號(hào)色譜柱分離效果符合要求。

通過(guò)相似度計(jì)算軟件[12]得到10批百合配方顆粒的對(duì)照?qǐng)D譜及各批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度，結(jié)果均大于0.990 0，表明各批次樣品之間相關(guān)性較好，投料所用的百合原藥材質(zhì)量較穩(wěn)定，百合配方顆粒工藝穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)中建立的采用HPLC檢測(cè)百合配方顆粒指紋圖譜方法穩(wěn)定性、重復(fù)性好、簡(jiǎn)便，能比較全面地反映百合配方顆粒的質(zhì)量，可作為百合配方內(nèi)控顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。