不同提取工藝對制何首烏含量的影響研究

董 鑫，左亞妹，李 敏，曹建軍

(亞寶藥業集團股份有限公司，山西 運城 044600)

何首烏為蓼科植物何首烏PolygonummultijiorumThunb.的干燥塊根，具有解毒、消癰、潤腸通便之功效，主要活性成分包含蒽醌類、二苯乙烯苷類、黃酮類、磷脂類等[1，2]。制何首烏為何首烏經黑豆汁制后的炮制加工品，具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨、化濁降脂等功效[3，4]。其中，2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(簡稱二苯乙烯苷，TSG)是何首烏最具代表的特征性成分，有降低膽固醇、增強免疫、抗骨質疏松、保肝等功效[5]，已被 2015 年版《中國藥典》作為何首烏質量控制的指標性成分。在工業化大生產中，提取、干燥方式的不同，工藝參數控制情況，都會影響制何首烏中二苯乙烯苷的含量；為盡可能減少二苯乙烯苷的破壞，提高含量，本研究采用不同的提取及干燥方式得制何首烏干膏粉，以二苯乙烯苷為指標，進行了含量測定，以確定最佳的提取工藝，為工業化生產提供理論依據。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；RE 52-99 型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-3200DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(塞多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 試藥

二苯乙烯苷(中國食品藥品檢定研究院，110844-201411，含量，93.2%)；乙腈(色譜純，Fisher 公司)；磷酸二氫鉀(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

制何首烏藥材由亞寶藥業集團股份有限公司購買自安徽易元堂中藥飲片科技有限公司(批號：20170101，含量，以2.3.5.4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(C20H22O9)計，2.21%；批號：20170301，含量，以2.3.5.4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(C20H22O9)計，2.03%；批號：20170501，含量，以2.3.5.4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(C20H22O9)計，2.09%)，均經質檢科鑒定復核。

2 方法與結果

2.1 制何首烏提取方法

2.1.1 70%乙醇提取 制何首烏藥材破碎，每份稱取300 g。加70%乙醇回流提取3次，每次加4倍量，提取時間分別為2 h、1 h、1 h，合并提取液，過濾，減壓濃縮回收乙醇，得浸膏1(相對密度1.00～1.10)，備用，平行制備3份。

2.1.2 水提醇沉 參照安神補腦膠囊國家食品藥品監督管理局標準，制何首烏藥材破碎，每份稱取300 g。加飲用水煎煮兩次，每次加12倍量，每次2 h，合并提取液，過濾，減壓濃縮至相對密度為1.25～1.32(50 ℃)的浸膏，放涼至室溫后緩緩加入乙醇，使含醇量達到50～55%，攪勻，靜置24 h，過濾，濾液回收乙醇，濃縮至原浸膏量。放涼至室溫后緩緩加入乙醇，使上述浸膏含醇量至60%～65%，靜置24 h，過濾，濾液回收乙醇，得浸膏2(相對密度1.00～1.10)，備用，平行制備3份。

2.2 制何首烏干燥方法

將上述所得浸膏1，浸膏2，各取100 g，分別采用真空干燥箱(60～75 ℃，0.04～0.08 MPa，12～24 h)和微波干燥(30～40 ℃，60～70 min)進行干燥，粉碎，得干膏粉。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5μm)；流速：1.0 mL·min-1；流動相：乙腈(A)-0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(B)(25∶75)；檢測波長：320 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；理論板數按2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰計算大于5 000。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品12.5 mg，置50 mL 棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置50 mL 棕色容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，配成濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取干膏粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷50 mL，超聲處理(功率250 W，頻率25 kHz)20 min，濾過，棄去濾液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙一同放回具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，精密稱量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，以稀乙醇補足減失的重量，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.3.4 標準曲線的建立 按“2.3.1”項下色譜條件，分別吸取“2.3.2”項下標準溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。回歸方程為：Y=752.8X+2.363，R2=0.999 6，結果表明二苯乙烯苷濃度為10～50 μg/mL時，濃度與峰面積呈良好的線性關系。見圖1、圖2和表1。

圖1 二苯乙烯苷對照品色譜

圖2 制何首烏干膏粉色譜

濃度積分回歸方程R2濃度范圍10μg/mL20μg/mL30μg/mL40μg/mL50μg/mL755.231 510.442 265.652 996.873 776.21Y=752.8X+2.3630.999610～50μg/mL

2.3.5 精密度檢驗 按“2.3.1”項下色譜條件，吸取對照品溶液20 μL，連續進樣5次，記錄峰面積。結果顯示，二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.28%，精密度好。

2.3.6 重復性檢驗 取同一干膏粉樣品6份，分別按照“2.3.3”項條件制成供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件測定，結果顯示，6份樣品的二苯乙烯苷峰面積的RSD為1.47%，重復性好。

2.3.7 穩定性檢驗 取一干膏粉樣品，按照“2.3.3”項條件制成供試品溶液，放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.3.1”項色譜條件測定，結果顯示，二苯乙烯苷峰面積的RSD為1.02%，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.8 加樣回收率實驗 取已知含量的干膏粉樣品6份，精密稱定，添加對照品溶液2 mL，平均回收率為99.7%，RSD為1.86%，表明此方法回收率良好。

2.4 不同提取方式的浸膏得率

計算不同提取方式所得浸膏的浸膏得率，70%乙醇提取浸膏得率明顯高于水提醇沉，P<0.05，具有統計學差異。見表2。

提取方式浸膏得率(%)70%乙醇25.64±0.08*水提醇沉15.21±0.75

注：與水提醇沉相比，*P<0.05。

2.5 不同提取及干燥方式對含量的影響

分別對不同提取方式所得浸膏，進行含量測定，結果顯示，水提醇沉浸膏含量為(1.80±0.46)%，70%乙醇提取所得浸膏含量為(0.87±0.10)%；水提醇沉略優于70%乙醇，差異無統計學意義(P> 0.05)。

分別對不同干燥方式所得干膏粉中的二苯乙烯苷進行含量測定，結果顯示，微波干燥所得干膏粉含量明顯高于減壓干燥，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

名稱烘干方式含量測量值(%)含量(%)P水提醇沉干膏粉微波干燥(n=3)減壓干燥(n=3)11.289.028.595.644.125.349.63±1.45*5.03±0.800.01770%乙醇干膏粉微波干燥(n=3)減壓干燥(n=3)7.166.975.233.133.114.326.45±1.06*3.52±0.690.028

注：與減壓干燥相比，*P<0.05。

3 結語

有文獻報道[5]，何首烏在炮制過程中，化學成分和藥理作用都發生了明顯的改變，藥效也隨之改變。何首烏經炮制后，二苯乙烯苷的含量低于生何首烏[6]，且隨炮制時間延長和溫度升高而降低。

本實驗結果表明，70%乙醇提取浸膏得率明顯高于水提醇沉，含量略低于水提醇沉，70%乙醇提取更適于工業化生產。微波干燥所得干膏粉含量明顯高于減壓干燥(P<0.05)；實驗過程中，減壓干燥溫度60～75 ℃，時間12～24 h，受熱時間較長，溫度較高，而微波干燥受熱時間和溫度都明顯低于減壓干燥，故含量較高。

在實際生產中，因70%乙醇提取工序簡單，浸膏得率較高，含量略低于水提醇沉，而微波干燥可以減少二苯乙烯苷的損失，故建議在工業化生產中采用70%乙醇對制何首烏進行提取，采用微波干燥法進行烘干，并嚴格控制干燥溫度、時間等參數，可滿足生產需求。