復(fù)方纈草膠囊揮發(fā)油部位的提取工藝優(yōu)化研究

陳相東，張 沖，鄧志權(quán)，徐正猛，樓一層

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

失眠是一種世界范圍內(nèi)的普遍問(wèn)題，據(jù)統(tǒng)計(jì)世界各國(guó)均存在較多失眠癥患者。在這些國(guó)家當(dāng)中巴西、美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)等國(guó)人口的失眠發(fā)病率較高，均在30%以上，其中巴西更是達(dá)到40%。我國(guó)患失眠癥的比例僅為25%，但是由于我國(guó)人口基數(shù)高，患病人數(shù)高達(dá)4億人，患病人數(shù)排在世界前列[1-3]。

復(fù)方纈草方是湖北省中醫(yī)院用于治療失眠的經(jīng)驗(yàn)方，已有多年的臨床應(yīng)用歷史。處方由纈草(ValerianaofficinalisL.)、夏枯草(Subtrib.BrunellinaeBriq)、棗仁(SemenZiziphiSpinosae)、茯神(SclerotiumPoriaeCircumRadicemPini)、半夏(RhizomaPinelliae)、燈心草(MedullaJunci)、炒梔子(FructusGardeniae)等多味中藥組成，具有補(bǔ)心養(yǎng)肝、養(yǎng)血安神的作用，常用于治療心肝血虛引起的頭暈、心煩、失眠等癥[1]，有著不錯(cuò)的效果。但在制備工藝上有些粗糙，還有許多值得改進(jìn)的地方。本研究擬采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化復(fù)方纈草膠囊的制備工藝，使制得的膠囊藥效高，穩(wěn)定性更好，為后續(xù)可能的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

FA-1004型分析天平(METTLER TOLEDO公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)式蒸(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司)；DHJF-2014型冷凝泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司)；SHB-Ⅲ型真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司)；HB-2型電子控溫水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司)；KQ-310DE型數(shù)字超聲清洗器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司)；GZX-3型真空干燥箱(德國(guó)Memmert公司)；HWZ-10B型微波真空干燥箱(德國(guó)Memmert公司)；1220型液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；AJC-0501-P型純水儀(美國(guó)艾科浦)。

乙腈(Aladdin科技有限公司，色譜純)；乙酸乙酯(Aladdin科技有限公司，色譜純)；甲醇(Aladdin科技有限公司，分析純)；乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品(Aladdin科技有限公司，批號(hào)21060328)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油部位的提取

稱取100 g纈草藥材粉碎成細(xì)粉放入加有足量沸石的反應(yīng)器中，然后倒入藥材重量8倍的純化水，振搖攪拌至藥粉完全浸泡于水中，充分吸水后靜置30 min待用。此時(shí)將反應(yīng)裝置搭好，向提取裝置中滴入純化水直至液面到達(dá)0刻度線，斜管處剛好溢流少量純化水至燒瓶為止。靜置結(jié)束后開(kāi)啟加熱裝置讓體系達(dá)到沸騰狀態(tài)，保持其沸騰狀態(tài)適度，當(dāng)15 min內(nèi)揮發(fā)油液面所在刻度無(wú)明顯變化時(shí)停止加熱，靜置5 min后打開(kāi)旋塞讓水緩慢滴出，當(dāng)揮發(fā)油層液面上端接近0刻度線時(shí)關(guān)閉活塞，靜置1 h。打開(kāi)旋塞至油層上端與0刻度線在同一水平線上，其下液面所對(duì)刻度即為總提取量。用無(wú)水Na2SO4對(duì)制得的揮發(fā)油進(jìn)行干燥，濾出后密封放置于棕色干燥器保存?zhèn)溆肹4-7]。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，本部分?jǐn)M選用浸泡時(shí)間A、液料比B和提取時(shí)間C為考察因素(見(jiàn)表1)，以乙酸龍腦酯提取率(mg·g-1)為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)型實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究(見(jiàn)表2)，同時(shí)按表1在不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)纈草揮發(fā)油進(jìn)行提取，將得到的復(fù)方纈草膠囊揮發(fā)油部位進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，并通過(guò)與乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比和綜合分析計(jì)算乙酸龍腦酯提取率(mg·g-1)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析與比較最終確定實(shí)驗(yàn)水平下的最優(yōu)生產(chǎn)條件[8-10]。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平因素

表2 各組正交實(shí)驗(yàn)條件

其中：Y為提取率；Cba為乙酸龍腦酯濃度；X為揮發(fā)油提取量；n為藥材總量。

2.3 乙酸龍腦酯的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱Agilent 19091J-413，30.0 μm×320 m×0.25 m彈性石英毛細(xì)管柱，最高溫度為325 ℃；檢測(cè)器：氫焰分析器；載氣為氮?dú)饧兌?9.99%，壓力為0.1 MPa，尾吹0.05 MPa，流速為1.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；汽化室溫：280 ℃，色譜柱溫度：初始溫度50 ℃平衡3 min，之后以8 ℃·min-1升溫速度加溫至100 ℃。再以17 ℃·min-1速度升溫直到加溫至不再有信號(hào)被檢測(cè)到(不得超過(guò)250 ℃機(jī)器上限)。以此方法對(duì)制好的對(duì)照品與供試品進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)分析計(jì)算揮發(fā)油部位乙酸龍腦酯的含量。

2.3.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備：取精密稱定后的乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品加至乙酸乙酯中溶解，定容后得到濃度為0.1 g·mL-1的體系作為母液按實(shí)驗(yàn)需求配制對(duì)照品。供試品溶液的制備：取纈草藥材100 g每組，經(jīng)上述方法進(jìn)行揮發(fā)油提取，取得到的揮發(fā)油0.6 g加入5 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯搖勻后定容至5 mL。得到的供試品溶液應(yīng)嚴(yán)格密封保存至干燥器中，在使用前應(yīng)用0.22μm濾膜過(guò)濾后再進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.3 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品，供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1，在相同保留時(shí)間上均有對(duì)應(yīng)峰(即乙酸龍腦酯)，可知其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響。

2.3.4 線性關(guān)系考察 將上述待用母液按需求分別進(jìn)行定量稀釋，制成濃度為0.02 g·mL-1、0.04 g·mL-1、0.06 g·mL-1、0.08 g·mL-1、0.10 g·mL-1的對(duì)照組溶液。用注射器分別取上述各組溶液用0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，各濃度組依次取1 μL作為對(duì)照品加至氣相色譜中按上述測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。通過(guò)統(tǒng)計(jì)與回歸分析得到回歸方程為：y=5141923.35x+ 2889.55，R2=0.9998，其中X為濃度值，Y為峰面積。標(biāo)準(zhǔn)品GC圖如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。上述結(jié)果表明當(dāng)對(duì)照組濃度為0.02～0.10 g·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，溶液濃度與各組峰積分面積呈現(xiàn)出線性關(guān)系，可以用此方程進(jìn)行分析計(jì)算。

圖1 乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品和供試品GC圖譜

表3 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖2 對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 依照實(shí)驗(yàn)組5因素水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與后續(xù)制備，制備產(chǎn)物重復(fù)檢測(cè)6次。各組實(shí)驗(yàn)乙酸龍腦酯提取率檢測(cè)數(shù)據(jù)如表4所示，6組實(shí)驗(yàn)提取率RSD為0.384%，證明此測(cè)定方法有著非常好的精密度。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取實(shí)驗(yàn)組5樣品于第0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)依次檢測(cè)，計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)乙酸龍腦酯提取率(表5)。經(jīng)計(jì)算提取率RSD為1.721%，表明本方法穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下的方法對(duì)同一批樣品提取揮發(fā)油共6次，將所得揮發(fā)油依次配制為供試品溶液并按上述檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)乙酸龍腦酯提取率(表6)。應(yīng)用本法提取率RSD為1.326%，證明本檢測(cè)方法可以非常好地被重復(fù)，可以作為一種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試手段。

表6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取六組相同體積樣品，各含0.053 0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，依次加入0.02 mg、0.02 mg、0.04 mg、0.04 mg、0.05 mg、0.05 mg乙酸龍腦酯標(biāo)準(zhǔn)品，超聲處理使其完全溶解。按上述檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)乙酸龍腦酯含量計(jì)算各組加樣后的總回收率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表7所示。數(shù)據(jù)顯示各組實(shí)驗(yàn)回收率均趨近于100%水平，RSD值為1.622%，表明本法作為一種含量測(cè)定方法具有非常好的準(zhǔn)確性，在標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)回收率滿足要求。

表7 加樣回收實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4 正交試驗(yàn)

取各實(shí)驗(yàn)組供試樣品2 μL依次按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析見(jiàn)表8、表9。

表8 直觀分析數(shù)據(jù)

表9 方差分析數(shù)據(jù)

根據(jù)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知：各因素R值分別為：0.254、1.560、7.747，RC>RB>RA，故各因素對(duì)提取率影響程度的重要性為C>B>A。根據(jù)表9中方差分析結(jié)果F值情況，可知因素C具有顯著性，而因素B的F值遠(yuǎn)大于A，但它們都不具有顯著性。提取率為正向優(yōu)勢(shì)數(shù)據(jù)，因此同一因素中k值大代表?xiàng)l件為優(yōu)。經(jīng)過(guò)上述分析A2B2C3為最佳條件。由于條件A即浸泡時(shí)間對(duì)提取率沒(méi)有顯著性影響且各組條件下數(shù)據(jù)差別不大，從減少實(shí)驗(yàn)所用時(shí)間的角度來(lái)講，應(yīng)選擇浸泡過(guò)程較短的0.5 h做為工藝的最優(yōu)浸泡條件。條件B的改變也對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著影響，但當(dāng)液料比為10∶1時(shí)，其K值相較于8∶1與12∶1均更高，與此同時(shí)考慮到對(duì)藥材更好浸泡等因素最終選擇最優(yōu)的B2條件即10∶1作為最優(yōu)的液料比。實(shí)驗(yàn)條件C，即提取時(shí)間對(duì)提取率有顯著性影響且隨提取時(shí)間增長(zhǎng)提取率也在增長(zhǎng)，故選擇C3條件即提取5 h作為最優(yōu)的揮發(fā)油提取工藝。最終確定以10倍量的純化水加至藥材中，浸泡0.5 h后進(jìn)行揮發(fā)油提取，總共提取5 h后收集提取到的揮發(fā)油成分并儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｓ捎谧罱K確定的工藝條件與上面提到的A2B2C3條件并不相同，因此決定以兩種條件分別各進(jìn)行三組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，考察其是否具有較大的差異性，同時(shí)驗(yàn)證工藝的可行性。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為測(cè)試上述正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的A1B2C3條件是否具有重復(fù)性與穩(wěn)定性，和是否與A2B2C3條件有較大差異，擬分別選用兩種條件按照“2.1”項(xiàng)下?lián)]發(fā)油提取工藝進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)各3組，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示，提取按照條件A1B2C3工藝進(jìn)行提取與條件A2B2C3進(jìn)行提取乙酸龍腦酯提取率基本一致，差異較小，且RSD為1.064%符合標(biāo)準(zhǔn)，表明本實(shí)驗(yàn)方案合理且穩(wěn)定可行。故最終確定以“將藥材細(xì)粉加至放有足量沸石的反應(yīng)器。之后倒入藥材重量10倍的純化水，振搖攪拌至藥粉完全浸泡于水中充分吸水后靜置30 min待用。開(kāi)啟加熱裝置讓體系達(dá)到沸騰狀態(tài)，保持適度沸騰5 h”作為制備處方揮發(fā)油部位的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案。

3 討論

揮發(fā)油提取技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)較為成熟，在這些方法當(dāng)中水蒸氣蒸餾法歷史悠久、操作簡(jiǎn)單高效是最常見(jiàn)的一種技術(shù)。諸如萃取法和冷壓法等也在其各自優(yōu)勢(shì)的領(lǐng)域發(fā)揮良好的提取效果。在實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)對(duì)方法操作難易程度、需要提取量與現(xiàn)有設(shè)備可行性等方面進(jìn)行綜合考量，最終選擇使用水蒸氣蒸餾法對(duì)纈草進(jìn)行提取。水蒸氣蒸餾法的應(yīng)用最為廣泛，方法成熟度較高，相對(duì)于溶劑萃取法、冷壓法等方法適應(yīng)性更廣、可行性較高。而通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)纈草揮發(fā)油可穩(wěn)定與水分層且浮于水層之上，證明纈草揮發(fā)油密度小于水的密度，可以應(yīng)用2015版《中國(guó)藥典》第四部通則2204項(xiàng)下甲法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

從上述分析可以看出，各因素對(duì)提取率影響程度的重要性依次為C>B>A。且因素A的顯著性最弱，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)方案為A2B2C3，但考慮到之后中試實(shí)驗(yàn)放大帶來(lái)的影響可能會(huì)增加浸泡時(shí)間，因此在可能的前提下應(yīng)盡可能減少浸泡時(shí)間，使得整體生產(chǎn)工藝更效率化、經(jīng)濟(jì)化。通過(guò)對(duì)A1B2C3和A2B2C3的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)比較，乙酸龍腦酯的提取率幾乎沒(méi)有影響，且RSD值均符合標(biāo)準(zhǔn)，因此最終確定的最佳提取工藝為A1B2C3，即“將藥材細(xì)粉加至放有足量沸石的反應(yīng)器。之后倒入藥材重量10倍的純化水，振搖攪拌至藥粉完全浸泡于水中充分吸水后靜置30 min待用。開(kāi)啟加熱裝置讓體系達(dá)到沸騰狀態(tài)，保持適度沸騰5 h”，這對(duì)于之后的中試生產(chǎn)有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。