RP-HPLC法測(cè)定烏梅不同炮制品及不同部位中枸櫞酸含量

孫 全，吳文輝，徐 沖，劉 霞，楊 敏，冷 靜

(重慶市中醫(yī)院 藥劑科，重慶 400021)

烏梅具有斂肺止咳、澀腸止瀉、生津止渴、安蛔止痛的功效，常用于肺虛久咳、久瀉久痢、虛熱消渴、蛔厥嘔吐、腹痛、虛熱消渴等癥。烏梅有烏梅肉、醋烏梅、烏梅炭等炮制品[1]。醋制法為烏梅最早的炮制方法，首載于漢代《金匱玉函經(jīng)》，現(xiàn)代理論認(rèn)為，醋制烏梅有增強(qiáng)收斂固澀作用，對(duì)肺虛久咳、兼有胃酸不足者尤為適宜。烏梅炒炭長(zhǎng)于收斂止血，可以使血液蛋白凝固，血管收縮[2]。也有觀點(diǎn)認(rèn)為烏梅炒炭的作用來(lái)源于炭的吸附以及有機(jī)酸。烏梅的主要物質(zhì)基礎(chǔ)為有機(jī)酸類，枸櫞酸在烏梅中的含量較高。藥理研究證明，烏梅水煎液具有較強(qiáng)和較廣的抗菌[3-6]、抗氧化[7-8]、鎮(zhèn)靜催眠[9]、對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎有一定的治療作用[10]。烏梅是否去核使用存在爭(zhēng)議，有人認(rèn)為烏梅去核耗時(shí)耗力，不應(yīng)去核。有人認(rèn)為烏梅核有機(jī)酸含量較低，所占比重大，應(yīng)該去核使用。烏梅不同炮制品以及不同部位中枸櫞酸的含量測(cè)定還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本文測(cè)定了烏梅不同炮制品及不同部位中枸櫞酸的含量，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，為烏梅的質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，XA205DU型十萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司)，烏梅(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號(hào)：D1506073)，枸櫞酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111679-200401)，AS10200AT型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 烏梅不同炮制品的制備 取烏梅藥材，分離果肉與果核部分，得到烏梅肉與烏梅核樣品。取烏梅藥材100 g，加入米醋200 mL，浸泡12 h，干燥。分離果肉與果核部分，得到醋烏梅、醋烏梅肉、醋烏梅核樣品。取烏梅肉，預(yù)熱炒藥鍋至100 ℃時(shí)投入烏梅肉100 g，并待鍋溫升至235 ℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，控制此溫度不變，共炒制8 min，迅速出鍋，熄滅火星，攤涼即得烏梅炭[11]。

1.2.2 溶液的制備 稱取烏梅不同炮制品及不同部位樣品1 g，加入50 mL的30%的甲醇，稱定重量，超聲(40 kHz，150 W)提取1 h，用30%的甲醇補(bǔ)足減失的重量。提取液用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。精密稱取枸櫞酸159.75 mg置于10 mL的容量瓶中，加入30%的甲醇稀釋至刻度，得到濃度為15.975 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm，流速：0.6 mL/min，柱溫：25 ℃，流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸梯度洗脫，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序 (%)

1.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液以及供試品溶液，各20 μL，進(jìn)樣，按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件分析，色譜見(jiàn)圖1。在供試品溶液的色譜中，有與混合對(duì)照品溶液中枸櫞酸保留時(shí)間相同的色譜峰，枸櫞酸的出峰時(shí)間為10.560 min，目標(biāo)峰與雜質(zhì)分離較好，峰形尖銳，目標(biāo)峰的理論塔板數(shù)不低于7 000，分離度大于1.5，說(shuō)明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

圖1 對(duì)照品(A)，烏梅提取物(B)的HPLC 色譜(1枸櫞酸)

1.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取枸櫞酸對(duì)照品溶液0.2、0.6、1.0、1.5、2 mL置5 mL容量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，即得系列對(duì)照品溶液，按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以枸櫞酸對(duì)照品溶液的濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，枸櫞酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、濃度線性范圍見(jiàn)表2。

表2 枸櫞酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、濃度線性范圍

1.2.6 加樣回收率 稱取已知含量的烏梅粉末9份，每份約0.1 g，分別精密加入烏梅粉末中枸櫞酸含量約80%、100%和120%的單體對(duì)照品溶液，按照“1.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算枸櫞酸的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 枸櫞酸的回收率試驗(yàn)結(jié)果 (mg, n=9)

1.2.7 穩(wěn)定性、精密度及重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取烏梅供試品溶液，室溫下放置0、4、8、12、24 h，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，枸櫞酸的RSD為0.56 %，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)符合測(cè)定要求。取枸櫞酸對(duì)照品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，枸櫞酸的RSD為0.47%，精密度實(shí)驗(yàn)符合測(cè)定要求。按供試品配制方法平行配制6份，按“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，枸櫞酸的RSD為0.75%。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)符合測(cè)定要求。

1.2.8 含量測(cè)定 取烏梅不同炮制品及不同部位樣品，按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.2.3”項(xiàng)下方法分析，測(cè)定不同炮制品及不同部位中枸櫞酸的含量。枸櫞酸的含量見(jiàn)表4。

表4 烏梅不同炮制品及不同部位中枸櫞酸的含量 (n=3)

2 討論

烏梅不同炮制品及不同部位中有機(jī)酸的含量差異較大，烏梅核中枸櫞酸的含量約為烏梅肉枸櫞酸含量的1/4。烏梅經(jīng)過(guò)醋制以后，枸櫞酸的含量有明顯的降低，可能是因?yàn)樵诖着莸倪^(guò)程中導(dǎo)致烏梅有機(jī)酸的損失。烏梅炭里面沒(méi)有檢測(cè)出枸櫞酸，說(shuō)明烏梅炒炭對(duì)有機(jī)酸的含量影響較大，烏梅是否去核使用存在爭(zhēng)議，烏梅不同炮制品及不同部位中枸櫞酸的含量測(cè)定可為烏梅的質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。