赤芝靈芝多糖與重金屬元素的質量評價研究

姜 濤，施枝江，羅 安，黃發軍，姚藝新，陳純純，翁玉萍

(康美藥業股份有限公司，廣東 揭陽 515300)

靈芝來源于多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(leyss. ex Fr.)Karst.或紫芝GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子實體，性平、味甘，歸心、肺、肝、腎經，具有“補氣安神，止咳平喘”之功效，臨床上用于治療心神不寧、失眠心悸、肺虛咳喘、虛勞短氣、不思飲食等[1]。現代研究表明，靈芝中含有多糖、三萜類化合物、有機酸、蛋白質、氨基酸等多種有效成分，具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、調節免疫等作用[2-9]。目前市面上流通的靈芝以赤芝用量較大，靈芝多糖是靈芝的有效成分之一，2015版《中國藥典》評測靈芝多糖含量以無水葡萄糖(C6H12O6)的含量來計算，且以不得少于0.90%作為評價指標之一[1]。近年來，中藥的安全性成為大家關注的焦點。2001年我國對外貿易經濟合作部頒布的《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》對藥用植物原料、飲片中的鉛(Pb)、鎘(Cd)、汞(Hg)、銅(Cu)、砷(As)實施了限量要求[10]，說明這5種重金屬元素的含量是評價藥材重金屬安全性的重要內容。目前《中國藥典》2015版未對重金屬元素進行限量要求，現有的文獻研究更多側重于微量元素的測定，未對赤芝的安全性評價進行全面研究，更未對其有效成分與重金屬元素進行相關性分析[11-13]。

電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)法具有靈敏度高、準確性好、精密度高、檢出限低，線性范圍寬等優點[14，15]。為此，本研究通過建立測定赤芝靈芝多糖的紫外分光光度法和5種重金屬含量的ICP-MS法，測定含量，運用主成分分析法比較不同樣品重金屬元素的差異，并結合多元相關性分析法研究靈芝多糖與5種重金屬之間的相關性，以期為赤芝的質量評價提供參考依據，現報道如下。

1 儀器、試劑及藥材

UV-2501PC紫外可見分光光度計(島津公司)；數顯恒溫水浴鍋(常州恒隆儀器有限公司)；XS105DU型電子天平(d=0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-300VDB三頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；安亭DL-5-B離心機(上海安亭科學儀器廠)；DGG-9030B鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；Multiwave PRO微波消解儀為奧地利安東帕公司生產；ICP-MS 7700x電感耦合等離子體質譜儀為安捷倫科技有限公司生產。

D-無水葡萄糖(批號：110833-201506)購于中國食品藥品檢定研究院(北京)；Pb(批號GSB04-1742-2004 )、Cd(批號GSB04-1721-2004)、Hg(批號 GSB04-1729-2004)、Cu (批號GSB04-1525-2004 )、As (批號GSB04-1714-2004)、Cr(批號GSB04-1723-2004)、Ge(批號GSB04-1728-2004 )、In(批號GSB04-1731-2004)、Bi(批號GSB04-1719-2004)、Au(批號GSB04-1715-2004)標準液均由國家有色金屬及電子材料分析測試中心生產；無水甲醇、冰醋酸、苯酚、高氯酸、冰醋酸、乙酸乙酯、香草醛均為分析純，由廣州化學試劑廠生產；鹽酸、活性炭、碘化鉀、硫酸均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司生產；丙酮、無水乙醇、乙醚均為分析純，由廣東光華科技股份有限公司生產；硫氰酸鉻銨由上海華精生物高科技有限公司生產。

14份赤芝藥材樣品分別從安徽各地收集，由康美藥業股份有限公司質量管理部劉茂貴主任藥師鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(leyss. ex Fr.)Karst的子實體。樣品信息見表1。

表1 14份赤芝樣品靈芝多糖和5種重金屬元素的含量及綜合得分

注：F值為主成分分析的綜合得分值。

2 方法

2.1 靈芝多糖的含量測定

2.1.1 對照品溶液的配制 取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得。

2.1.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，搖勻)6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15 min，取出，以相應的試劑為空白對照，在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得A=0.027 54X+0.022 06，r=0.999 0。

2.1.3 供試品溶液的配制 取本品粉末約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水60 mL靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣用水5 mL溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75 mL，搖勻，在4 ℃放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

政治文本中的隱喻翻譯研究——以《2016年政府工作報告》為例 衛明高,余高峰,喬俊凱 40(2)120

2.1.4 靈芝多糖的方法學考察 精密度考察：取同一份靈芝樣品供試液，連續6次測定吸光度，其RSD為0.45%(n=6)，表明儀器的精密度良好。穩定性考察：取同一份靈芝樣品的供試液，分別于制備后0、10、20、40、60、80、120 min 測定吸光度，其RSD為1.34%(n=7)，表明所用供試液在2 h內穩定。重復性考察：取同一份靈芝樣品粉末6份，制備成供試液，測定靈芝多糖的含量，其RSD為1.65%(n=6)，表明所用方法的重復性良好。加樣回收試驗：精密稱取2 g已測定靈芝多糖含量的靈芝樣品粉末6份，分別精密加入與樣品中靈芝多糖含量相當的無水葡萄糖對照品溶液，制備供試液，測定靈芝多糖的含量，其平均回收率為98.24%，RSD為1.68%(n=6)，表明所用方法的準確性良好。

2.1.5 樣品測定 精密量取供試品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“2.3.2”項下“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，計算，即得。

2.2 Pb、Cd、As、Hg、Cu的含量測定

2.2.1 鉛、鎘、砷、銅、汞標準品貯備液的制備 分別精密量取鉛、砷、鎘、汞、銅單元素標準溶液適量，用10%硝酸溶液稀釋制成1 mL分別含鉛、砷、鎘、汞、銅為1 μg、0.5 μg、1 μg、1 μg、10 μg的溶液，即得標準品貯備液。

2.2.2 內標溶液的制備 精密量取鍺、銦、鉍單元素標準溶液適量，用水稀釋制成每1 mL各含1μg的混合溶液，即得。

2.2.3 ICP-MS的測定條件 等離子氣流量：15.0 L·min-1；蠕動泵轉速：0.20 r·s-1；霧化室溫度：2 ℃；輔助氣流量：0.8 L·min-1；He氣流量：5 mL·min-1；載氣流量：0.8 L·min-1；射頻功率：1 550 W；數據采樣模式：跳峰采集模式；采樣深度：10 mm；重復次數：3次；描次數：100次。

2.2.4 標準曲線的制備 精密量取鉛、鎘、銅、砷標準品貯備液適量，用10%硝酸溶液稀釋制成每1 mL含鉛、砷0 ng、1 ng、5 ng、10 ng、20 ng，含鎘0 ng、0.5 ng、2.5 ng、5 ng、10 ng，含銅0 ng、50 ng、100 ng、200 ng、500 ng的系列濃度混合溶液，即得。另精密量取汞標準品儲備液適量，用10%硝酸溶液稀釋制成每1mL分別含汞0ng、0.2ng、0.5ng、1ng、2ng、5 ng的溶液，本液應臨用配制。63Cu、75As以72Ge作為內標，114Cd以115In作為內標，202Hg、208Pb以209Bi作為內標，繪制標準曲線，詳見表2。

表2 重金屬元素的回歸方程及相關系數

2.2.5 供試品溶液的制備 取供試品于60 ℃干燥2 h，粉碎成粗粉，取0.5 g，精密稱定，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5～10 mL(如果反應劇烈，放置至反應停止)。密閉并按微波消解儀的相應要求及一定的消解程序進行消解。消解完全后，消解液冷卻至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，將消解液轉入50 mL量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入金單元素標準溶液(1 μg/mL)200 μL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(如有少量沉淀，必要時可離心分取上清液)。除不加金屬元素標準溶液外，余同法同時制備試劑空白溶液。

2.2.6 方法學考察 精密度試驗：取混合標準品溶液連續進樣 6次，測定這5種元素的量，Pb、Cd、Hg、Cu、As的RSD分別為 3.12%、1.54%、1.66%、1.17%、2.12%、2.33%。表明儀器的精密度良好。重復性試驗：取同一份赤芝樣品粉末6份，制備成供試品溶液，測定這6種元素的量。Pb、Cd、Hg、Cu、As的RSD值分別為1.21%、2.11%、1.15%、1.38%、2.54%，表明此方法的重復性良好。穩定性試驗：取同一份赤芝樣品供試液，在選定樣品測定條件下，分別于制樣后 0、5、10、15、20、25、30、35 h 進樣，測定這5種元素的量。Pb、Cd、Hg、Cu、As的RSD值分別為1.38%、1.52%、2.01%、2.22%、2.96%，表明在樣品制備35 h內各成分是穩定的。

3 結果與分析

3.1 赤芝中靈芝多糖含量的比較

14份赤芝樣品靈芝多糖的含量均符合2015年《中國藥典》的要求，含量范圍為0.95% ～ 2.55%，平均值為1.35%(n=14)。

3.2 赤芝5種重金屬元素含量的比較

14份赤芝鉛元素有2份樣品未檢出，平均值為0.12 mg/kg(n=14)；鎘元素有4份樣品未檢出，平均值為0.12 mg/kg(n=14)；砷元素有1份樣品未檢出，平均值為0.07 mg/kg(n=14)；汞元素有6份樣品未檢出，平均值為0.02 mg/kg(n=14)；銅元素有5份樣品未檢出，平均值為3.41 mg/kg(n=14)。

把14份赤芝5種重金屬元素含量的結果代入SPSS19.0統計學軟件，設置提取因子數目為5，進行主成分分析，得到解釋的總方差和成分矩陣，結果見表3、表4。

表3 解釋的總方差 (%)

注：提取方法為主成分分析。

表4 成分矩陣a

注：a.提取方法為主成分分析；已提取了5個成分。

分析表3總方差的解釋和表4成分矩陣，結果表明，5個主成分的初始特征值分別為1.768、1.496、1.013、0.525、0.198，累積百分比為100%，計算得到主成分1、2、3、4、5的表達式分別為：

Z1=0.801*Pb+0.69*Cd+0.706*As+0.329*Hg+0.208*Cu

Z2=0.458*Pb-0.441* Cd-0.569*As+0.791*Hg+0.379*Cu

Z3=0.017*Pb-0.226* Cd+0.151*As-0.441*Hg+0.863*Cu

Z4=-0.283*Pb+0.521* Cd-0.313*As+0.108*Hg+0.252*Cu

Z5=-0.261*Pb-0.081* Cd+0.241*As+0.246*Hg+0.068*Cu

把5個主成分相加，得到總的表達式Z總=2.303*Pb+0.589*Cd+0.433*As+1.424*Hg+1.955*Cu，把5種重金屬元素的含量代入Z總，得到每份樣品的綜合得分值，詳見表1。

14份赤芝5種重金屬元素的主成分分析的結果有所不同，綜合得分值越高，安全性越低。1～14號樣品的綜合得分值分別為9.227、0.238、10.944、6.344、2.025、0.091、0.549、18.551、10.848、12.671、0.548、0.193、15.202、10.962，說明不同赤芝樣品之間的重金屬方面的安全性不同。

3.3 赤芝靈芝多糖與重金屬元素的相關性分析

把5種重金屬元素的含量作為自變量，靈芝多糖的含量作為因變量，帶入SPSS19.0統計學軟件進行逐步回歸分析，結果見表5至表8。

表5 輸入/移去的變量b

注：已輸入所有請求的變量；因變量：靈芝多糖。

表6 模型匯總

注：a. 預測變量：(常量)，銅，砷，汞，鎘，鉛。

表7 ANOVAb

注：a.預測變量：(常量)，銅，砷，汞，鎘，鉛；b.因變量：靈芝多糖。

表8 系數a

注：a. 因變量：靈芝多糖。

從表8可以看出，只有鎘元素與靈芝多糖的相關性通過可靠性分析，P=0.045<0.05，相關系數為-0.025，說明鎘元素與靈芝多糖呈負相關，二者的表達式為：Y(靈芝多糖)=-0.025*X(鎘元素)+0.012。

產地、菌種、菌絲體、菌株對靈芝中靈芝多糖的含量都有不同程度的影響[16-20]。而生長期對靈芝中靈芝多糖含量影響較大，現蕾期時最高，芝蓋形成期有所降低，成熟期又有所增加，衰老期又大幅度降低[21]。在生長過程中，UDPGPPlase、α-PGM和PGI是靈芝多糖合成的關鍵酶[22]，各部位基質中的靈芝胞外酶活性與物質量具有一定的相關性[23]。靈芝不同部位的多糖含量差異較大，即：發酵菌絲體>菌蓋表皮層>孢子粉>菌柄>木栓層[24]。不同生長時期的靈芝用不同體積分數乙醇沉淀靈芝多糖，人工栽培與野生對靈芝多糖也有一定影響[25，26]。這說明產地、菌種、菌絲體、菌株、生長期等對靈芝中靈芝多糖均有不同程度的影響；而不同樣品中5種重金屬元素的含量有所不同，可能與赤芝自身對某些元素的富集或者與環境的污染有關，需要進一步深入研究。

4 結語

本研究建立的赤芝靈芝多糖的紫外分光光度法和5種重金屬元素含量的ICP-MS方法準確、可靠、重現性好。從藥效的角度來看，不同赤芝樣品的質量存在一定差異，從安全性的角度來看，其安全性有所不同。鎘元素與靈芝多糖呈負相關，即鎘元素含量越高，靈芝多糖的含量越低。