HPLC法測定木瓜中齊墩果酸和熊果酸的含量

代 琪，羅 霄，葉俏波

(1. 成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610045；2.成都 中醫藥大學 方劑學教研室，四川 成都 611137)

《中國藥典》2015版第一部木瓜含量測定項下方法以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(265∶35∶0.1∶0.05) 為流動相，柱溫16～18 ℃，結果發現此流動相下齊墩果酸和熊果酸的分離效果不佳，齊墩果酸和熊果酸的色譜峰分離度<1.5，而且此流動相在210 nm波長下測定基線有波動，會對峰面積造成影響，故對木瓜的含量測定條件進行了改進。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters-2998高效液相色譜儀(Waters-e2695 Photodiode Array Detector 檢測器，Empower pro自動進樣色譜工作站，美國Waters公司)，Anilent 1260高效液相色譜儀(Anilent 1260 DAD檢測器，LC openLAB自動進樣色譜工作站，安捷倫科技有限公司)，METTLER TOLEDO電子天平(Max 21 g,d=0.01 mg,梅特勒-托利多儀器廠)，KQ-500E 型超聲波清洗器(頻率：40 kHz，超聲電功率：500 W，清洗容量：22.5 L,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 對照品

齊墩果酸(110709-201607，含量為91.7%，供含量測定用)，熊果酸(110742-201622，含量為94.7%，供含量測定用)，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 樣品

木瓜樣品25批，詳見表1。

表1 木瓜樣品來源

1.4 試劑試藥

流動相中的乙腈為色譜純，其他試劑試藥均為分析純。

2 色譜條件與系統適應性試驗

2.1 檢測波長的選擇

齊墩果酸、熊果酸檢測波長的選擇。參照《中國藥典》2015年版第一部木瓜含量測定項下，進行了紫外光譜掃描測定，結果齊墩果酸、熊果酸和木瓜供試品溶液均為末端吸收，在波長為210 nm下均有最大吸收，故選定波長為210 nm。

2.2 洗脫條件選擇

2.2.1 藥典方法 參考《中國藥典》2015版第一部木瓜含量測定項下方法[1]以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(265∶35 ∶ 0.1 ∶ 0.05) 為流動相，柱溫16～18 ℃，流速0.8 mL/min、0.5 mL/min，此流動相下齊墩果酸和熊果酸的分離效果不佳，流速0.8 mL/min分離度為1.08，流速0.5 mL/min分離度為1.27，而且此流動相在210 nm波長下測定基線有波動，會對峰面積造成影響，故不選用此流動相。

2.2.2 其他洗脫條件的篩選 根據文獻[2]以甲醇-水(88∶12)為流動相，流速1.0 mL/min，發現此流動相下齊墩果酸和熊果酸的色譜峰完全不能分離，故不選用此流動相。根據文獻[3]以甲醇-0.1%磷酸(85∶15)為流動相，流速1.0 mL/min，發現此流動相下色譜峰峰形不理想，而且齊墩果酸和熊果酸的分離效果不佳，分離度為0.98，故不選用此流動相。以甲醇-0.1%氨水(85∶15)為流動相，流速1.0 mL/min，結果發現此流動相下色譜峰峰形較好，但是齊墩果酸和熊果酸的色譜峰分離效果不佳，分離度為1.08，故不選用此流動相。根據文獻[4]以甲醇-0.2%乙酸銨(85∶15)為流動相，流速1.0 mL/min，實驗顯示此流動相下齊墩果酸和熊果酸的分離效果一般，分離度為1.39，但是色譜峰峰形不夠理想，此流動相在210 nm波長下測定基線有波動，會對峰面積造成影響，故不選用此流動相。根據文獻[5]以甲醇-乙腈-0.2%磷酸(5∶82∶13)為流動相，流速1.0 mL/min，實驗發現此流動相下色譜峰峰形不理想，而且墩果酸和熊果酸的分離效果不佳，分離度為0.94，故不選用此流動相。以甲醇-乙腈-0.5%醋酸(67∶19∶14)為流動相，流速0.5 mL/min，實驗研究發現，此流動相下色譜峰峰形不理想，而且齊墩果酸和熊果酸的分離效果不佳，分離度為1.02，故不選用此流動相。根據文獻[6]以乙腈-0.2%醋酸(75∶15)為流動相，流速1.0 mL/min，實驗發現此流動相下齊墩果酸和熊果酸的色譜峰不能完全分離，故不選用此流動相。

2.2.3 最終確定的洗脫條件 根據文獻[7]最終選定的流動相為：乙腈-0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH=7.5)(70∶30)，流速1.0 mL/min，在該流動相條件下，熊果酸和齊墩果酸色譜峰峰形好，且均能較好地分離，對照品和樣品的分離度均>2.0，出峰時間適中，所以選定乙腈-0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH=7.5)(70∶30)為標準中的流動相。齊墩果酸、熊果酸對照品及樣品(CD-15)色譜見圖1、圖2。

2.3流動相的選擇

2.3.1 pH值篩選 因為C18柱的一般pH適應范圍為2～8，所以對乙腈-0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH=7.5)(70∶30)中0.1%氨水溶液的pH值進行了7.0、7.5和8.0三個梯度的考察，流速0.8 mL/min，實驗研究發現pH值越高齊墩果酸、熊果酸出峰越快，分離度越高，pH=7.0時分離度為1.88，pH=7.5時分離度為2.14，pH=8.0時分離度為2.25，考慮到C18柱的一般pH適應范圍為2～8，pH=8.0時為C18柱能承受的邊緣，而pH=7.0時分離度<2.0，綜合考慮選用乙腈-0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH值=7.5)(70∶30)為流動相，分離度>2.0，且出峰時間合適。

圖1 選定流動相下齊墩果酸、熊果酸對照品色譜(1.0 mL/min)

圖2 選定流動相下樣品(CD-15)色譜(1.0 mL/min)

2.3.2 流動相比例篩選 考察流動相中乙腈和0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH=7.5)的3個比例：65∶35、70∶30、75∶25，流速1.0 mL/min，實驗結果發現在乙腈和0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH=7.5)的3個比例：65∶35、70∶30、75∶25下齊墩果酸、熊果酸均能很好的分離，分離度隨著乙腈比例增大而降低，分別為2.38(65∶35)、2.13(70∶30)、1.81(75∶25)，乙腈比例大出峰時間快，綜合考慮，故選用乙腈-0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH=7.5)(70∶30)。

2.4 流速選擇

文獻中對齊墩果酸和熊果酸進行高效液相分離時常選用<1.0 mL/min的流速，現對選定方法：乙腈-0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH=7.5)(70∶30)的流速進行篩選，考察了1.0 mL/min、0.9 mL/min和0.8 mL/min三個流速，結果表明在1.0 mL/min、0.9 mL/min和0.8 mL/min 3個流速下齊墩果酸、熊果酸均能很好的分離，分離度分別為2.14(1.0 mL/min)、2.12(0.9 mL/min)、2.14(0.8 mL/min)，分離度均在2.0以上，并無明顯差別，流速越大出峰時間越快，故選用1.0 mL/min作為流速。

2.5 色譜柱篩選

在流動相為乙腈-0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH=7.5)(70∶30)、流速1.0 mL/min，比較色譜柱Waters Sunfire TM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、CAPCELL PAK C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)、SHIMADZU VP-ODS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，結果齊墩果酸和熊果酸均可以達到基線分離，分離度均在2.0以上，峰形對稱。色譜柱越短出峰時間越快。

另外還在Anilent 1260高效液相色譜儀進行了測定，與Waters-e2695高效液相色譜儀一樣，結果齊墩果酸和熊果酸可以達到基線分離，分離度在2.5以上，峰形對稱，效果較好。

實驗結果表明，選定條件在各種品牌、長短的色譜柱和各種高效液相色譜儀下均能很好地分離齊墩果酸和熊果酸。

2.6 柱溫篩選

《中國藥典》2015版第一部木瓜含量測定項下規定柱溫為16～18 ℃，在選定色譜條件的實驗中發現柱溫對實驗影響不大，考察了25 ℃、30 ℃和35 ℃ 3種柱溫對實驗的影響，由實驗結果可知，柱溫升高出峰時間稍提前，柱溫升高分離度稍降低，總體看來柱溫對齊墩果酸和熊果酸的分離影響不大，故不設定柱溫。

3 其他條件的篩選和樣品測定

3.1 對照品溶液制備

齊墩果酸、熊果酸均易溶于甲醇，故以甲醇作溶劑。通過對不同進樣量以及樣品中兩種成分含量的比例的考查，結果齊墩果酸、熊果酸一次進樣量0.5～1μg，峰高適中，柱效高，峰形好，與樣品峰面積相匹配。以進樣5～10 μL計，對照品溶液濃度定為齊墩果酸、熊果酸0.1 mg/mL。

3.2 供試品溶液的制備

3.2.1 取樣量確定 參考《中國藥典》2015版第一部木瓜質量標準含量測定項下，并對木瓜樣品的含量測定可知，取樣量為0.5 g時，供試品溶液濃度與對照品溶液濃度相當，峰高適中，柱效高，峰形好。

3.2.2 提取溶媒選擇 參考《中國藥典》2015版第一部木瓜質量標準含量測定項下，取同一批樣品內容物0.5 g，精密稱定，分別置磨口錐形瓶中，分別加甲醇、乙醇、無水乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，分別用甲醇、乙醇、無水乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。按選定色譜條件測定，結果三種供試品溶液峰對稱性好，柱效高，峰形好，效果理想，但三種溶劑提取含量分別為甲醇>乙醇>無水乙醇。并且《中國藥典》2015版第一部木瓜質量標準含量測定項下也是采用甲醇作為提取溶劑，故采用甲醇作為提取溶劑。

3.2.3 提取方法和時間選擇 取同一批木瓜樣品內容物0.5 g，精密稱定，分別置磨口錐形瓶中，分別加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，分別超聲處理10 min、20 min、30 min和40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。再取同一批木瓜樣品內容物0.5 g，精密稱定，分別置磨口錐形瓶中，分別加入甲醇25 mL，稱定重量，分別加熱回流20 min、30 min和40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。測定結果表明，超聲提取30 min和回流提取30 min齊墩果酸和熊果酸的含量最高，但是超聲提取操作更簡便，損失更小，并參考《中國藥典》2015版第一部木瓜質量標準含量測定項下的提取方法，選用超聲提取30 min作為提取供試品的提取方法和時間。

3.3 線性關系與標準曲線

精密稱取齊墩果酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110709-201607，含量91.7%)9.42 mg、熊果酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110742-201622，含量94.7%)8.68 mg，同置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，作對照品濃溶液。精密吸取對照品溶液0.5、1、2、4、8、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，按選定色譜條件測定，結果齊墩果酸進樣量在43.19～1 727.63 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系；回歸方程：Y=585.566 6X- 9 130.240 5；相關系數：r=0.999 9。同時熊果酸進樣量在41.10～1 643.99 g范圍內與峰面積呈良好的線性關系；回歸方程：Y=477.696 7X-5 805.706 9；相關系數：r=0.999 9。

3.4 穩定性試驗

對同一份供試品溶液，24h內測定9次，進樣10 μL，測定結果：RSD均<3.0%，表明供試品溶液在35 ℃下放置24 h內相對穩定。

3.5 重復性試驗

對同一批樣品按選定方法平行實驗6次，測定結果：RSD均<3.0%，表明樣品含量測定重復性良好。

3.6 精密度試驗

對同一份齊墩果酸(0.096 8 mg179/mL)和熊果酸(0.104 9 mg/mL)混合對照品溶液，重復進樣6次，進樣10 μL，測定結果：RSD均<3.0%，表明對照品溶液進樣精密度良好。

3.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量樣品(CD-15)9份，每3份一組，置具塞三角瓶中，每一組分別精密加入混合對照品溶液(齊墩果酸0.399 8 mg/mL，熊果酸1.879 8 mg/mL)0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，加甲醇至25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。按選定色譜條件測定含量，結果見表2、表3。

表2 齊墩果酸回收率測定結果

表3 熊果酸回收率測定結果

由表2、表3可見，本法平均加樣回收率在99%～106%范圍內，RSD均在2.0%范圍內，表明回收率重現性較好，測定方法可靠。因此，最終確定木瓜含量測定的標準為：

色譜條件與系統適用性試驗。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH值至7.5)(70∶30)為流動相；檢測波長210 nm。理論塔板數按齊墩果酸峰計算應不低于5 000。

對照品溶液的制備。取齊墩果酸對照品、熊果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各約含0.1 mg的混合溶液，即得。

供試品溶液的制備。取本品細粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

測定法。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10～20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

3.8 樣品含量測定

取收集的25批木瓜樣品，按選定方法測定齊墩果酸和熊果酸的含量。結果見表4。

表4 25批樣品含量測定結果 (%，n=3)

4 討論

齊墩果酸和熊果酸為木瓜中重要的有效成分，也是區別木瓜與其他混偽品的重要鑒別成分，齊墩果酸和熊果酸為同分異構體，分子量相近，性質極為相似，給分離測定帶來一定難度。《中國藥典》2015版第一部木瓜含量測定項下方法以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(265 ∶ 35 ∶ 0.1 ∶ 0.05) 為流動相，控制柱溫為16～18 ℃，操作繁瑣復雜，用此方法測定齊墩果酸和熊果酸的分離效果不佳，分離度<1.5，而且實驗研究發現凡是流動相中使用了胺或者銨，均對210 nm波長下的基線有影響，會造成峰面積的波動。

選定的流動相為乙腈-0.1%氨水溶液(用磷酸調節pH=7.5)(70∶30)，不需要控制柱溫，各種色譜柱下均能對齊墩果酸和熊果酸進行很好的分離，分離度均在2.0以上。

本研究所建立的方法操作簡便，環境污染小，增強了質量標準的可控性，同時發現用此流動相分離其他藥材中的齊墩果酸和熊果酸，仍能達到很好的效果。