兩種乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑的檢驗重復性與一致性比較

華燕美

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)不僅可引起人類急、慢性肝炎，還能進展為肝硬化，甚至是肝癌，并且肝癌死亡率較高[1-2]。研究發現，HBV DNA持續復制水平越高，發生肝癌的可能性就越大[3]。因此，評價乙型肝炎治療效果和預后最重要也是最直觀的方法就是檢測HBV核酸定量檢測[4-5]。目前, 國內出現了一系列商品化HBV核酸檢測試劑盒，但其與國外進口原裝試劑盒之間的性能差異尚不明確。因此，本文選擇了羅氏原裝與國產乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒進行了重復性與一致性比較。

資料與方法

一、樣本來源

使用WHO HBV DNA標準品，先用0.5mL去離子水溶解，再用陰性人血清梯度稀釋至所需滴度，HBV DNA 滴度分別為60、170、1 700、17 000 IU/mL，每個滴度檢測20次。收集2016 年8月—12月在我院正在接受乙肝抗病毒治療的患者或復診患者血清，HBV DNA 載量為<50、50～200、～102、～103、～104、～105、～106、～107、～108 IU/mL，每組10例，年齡29～57歲，樣本抗-HAV、抗-HCV、抗-HEV均為陰性。

二、研究方法

HBV核酸定量檢測羅氏試劑使用平臺：cobasAmpliPrep/cobasTaqMan,采用羅氏HBV DNA定量檢測試劑盒(靈敏度20 IU/mL，線性范圍20～1.7×108IU/mL)，嚴格按照說明書進行操作。國產試劑使用平臺：核酸提取儀DP1 000、Cobas Z480實時熒光定量PCR儀，采用國產乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(靈敏度50 IU/mL，線性范圍50～5.0×108IU/mL)，嚴格按照說明書進行操作。大致步驟如下：采用磁珠法進行提取HBV DNA后，然后進行低速離心，將樣品加入到定量PCR儀中， 50℃反應2min，在94℃下進行保溫5 min，進行94℃ 10 s～60℃ 45 s循環，完成40個循環，60℃采集熒光通道信號，并計算各樣本HBV DNA含量(IU/mL)。

三、統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。單因素方差分析(ANOVA)檢測操作者間或操作者內差異，計算組內相關系數(ICC)判斷組內一致性。計算兩者間相關系數R，進行Bland-Altman圖繪制。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

結 果

一、 兩種試劑的溯源性和重復性

3名操作者分別對WHO標準HBV DNA樣品(17 000 U/mL)進行檢測：羅氏檢測測結果分別為(1.66±0.13)、(1.68±0.21)、(1.66±0.11)×104IU/mL國產檢測結果分別為(1.89±1.51)、(1.62±1.66)、(2.13±1.45) ×105IU/mL。三名操作者間差異無統計學意義(羅氏F=2.59，P>0.05；國產F=2.06,P>0.05)，說明不同操作者間重復性良好。

從3名操作者中隨機抽取1人，隔日對每一樣本重復測量3次，羅氏檢測結果分別為(1.66±0.13)、(1.67±0.12)、(1.69±0.13)×105IU/mL,國產檢測結果分別為(1.89±1.51)、(1.92±1.71)、(1.74±1.65) ×105IU/mL。同一操作者內操作差異無統計學意義(羅氏F=1.02,P>0.05；國產F=1.16,P>0.05)，說明同一操作者不同操作間重復性良好。

兩種試劑檢測4個滴度(60、170、1 700、17 000 IU/mL)的WHO HBV DNA標準品，每個滴度分別檢測24次，均值及SD見表1。羅氏檢測試劑ICC值為0.93(F=12.51,P<0.0001)，國產檢測試劑ICC值為0.82(F=8.72,P<0.0001)，羅氏檢測試劑組內重復性優于國產試劑。

表1 兩種HBV DNA定量重復檢測HBV DNA 標準品結果(以對數形式表示)

二、兩種試劑的一致性

兩種試劑檢測9組不同HBV DNA滴度的患者血清樣本，每組10例，結果進行相關性分析，兩者相關系數r=0.849,P<0.0001，相關性良好(圖1)。兩組臨床血清檢測的Bland-Altman圖，可見兩種檢測試劑結果差值90%的位點位于95%置信區間參考范圍內，說明兩種檢驗方法間一致性良好(圖2)。

圖1 兩種乙型肝炎病毒核酸檢測試劑檢測結果的相關圖

注：虛線代表Y=0，其他三條線分別代表Y=兩種方法差值均數，Y=兩種方法差值均數+1.96SD；以及Y=兩種方法差值均數-1.96SD。

圖2兩種乙型肝炎病毒核酸檢測試劑差異Bland-Altman圖

討 論

HBV DNA的病毒載量通常被認為是衡量HBV 復制情況的“金標準”[6-8]。HBV DNA的定量檢測是檢測病毒拷貝數最直接、最可信賴的方法，可以幫助確診隱性HBV感染和隱性慢性乙型肝炎，并對乙肝活動期患者的病毒監控提供臨床指導意義[9-11]。目前，在我國檢測乙型肝炎病毒核酸定量的檢測試劑盒種類繁多，除了最經典的羅氏原裝進口試劑盒外，還有國產試劑盒生產商包括湖南圣湘、上海科華等等。由于不同HBV檢測試劑可能會帶來不同的結果[12],這使得檢驗報告不能給醫生的臨床治療帶來有效的指導，也使得不同實驗室之間無法互認，出現交流障礙。因此，對不同檢驗試劑進行重復性與一致性評價，并分析之間的相關性具有重要的臨床意義。

本課題組選擇了羅氏原裝與國產乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑進行了WHO標準HBV DNA樣品和患者血清樣本檢測，結果發現羅氏檢測結果更接近于真實值，數值波動程度小。3名操作者間差異無統計學意義，說明不同操作者間重復性良好。同一操作者內操作差異無統計學意義，說明同一操作者不同操作間重復性良好。而組內一致性檢測發現羅氏試劑ICC值為0.88(P<0.01)，國產試劑為0.74(P<0.01)，證實了羅氏檢測試劑重復性優于國產試劑。這可能是因為國產和進口試劑盒在病毒載量損耗和試劑制備方面的不同，影響了定量檢測結果的重復性。類似的是，有學者報道國產試劑盒在產品的整體設計上已基本達到國外同類產品水平，但實際上靈敏度及檢測下限方面卻有著較大波動[13-14]。因此，國產HBV DNA定量檢測試劑仍需進一步改進并提高檢測質量。

本課題組進一步進行了相關性分析，發現兩者相關系數r=0.849,P<0.0001，相關性良好(圖1)。而Bland-Altman圖可見兩種檢測試劑結果差值90%的位點位于95%置信區間參考范圍內，說明兩種檢驗方法一致性良好(圖2)。由此可見，雖然國產試劑重復性低于羅氏原裝進口試劑盒，但兩者檢測結果一致性較好，說明國產HBV DNA定量檢測試劑作為一種廉價高效檢測手段具有良好的應用前景，可以在貧困偏遠地區進行普查或者臨床上進行輔助使用。在需要對結果進一步精確測定時應選擇羅氏原裝試劑，是臨床應用的“金標準”。利用羅氏原裝試劑作為統一的標準進行評價和監測，可以實現HBV DNA定量測定結果的一致，保證為臨床醫生質量提供指導的準確性。