葡萄HAK基因家族的鑒定與表達分析

馬麗娟，馬 鈺，何紅紅，梁國平，萬 鵬，陳佰鴻，毛 娟

(甘肅農業大學 園藝學院，蘭州 730070)

葡萄(VitisviniferaL.)作為世界四大水果之一，食用價值高，而且營養豐富。近年來，葡萄種植區域逐漸向南、北擴增種植[1]。西北地區由于具有適宜葡萄生長的生態環境，已經發展成為國內重要的葡萄與葡萄酒產區。然而，由于西北地區的土壤和天氣狀況，如：干旱、低溫凍害頻繁發生，土壤鹽漬化程度高，使得西北地區貧瘠的土壤和脆弱的生態環境成為制約葡萄產業發展的瓶頸。

高親和性鉀離子轉運體基因(high affinity K+transporter，HAK)是高親和K+吸收轉運體基因KUP/HAK/KT家族中的一員，HAK轉運家族也稱為KUP或KT轉運家族[2]，是植物鉀離子轉運載體4個家族(KUP/HAK/KT家族、Trk/HKT家族、KEA家族、CHX家族)中成員最多的一個家族，為H+/K+同向轉運載體，主要介導植物中K+等元素的吸收轉運和根部生長素的運輸[3-5]。研究表明，該家族基因的表達受植物自身生長發育，調節因子和環境刺激等因素的調控，參與植物的生長發育和逆境響應機制[6]。其中，HAK基因的表達能使植物在低鉀及鹽脅迫條件下提高對K+的吸收能力，維持正常的K+濃度和生理功能，保持低Na+/K+比，從而提高植物的耐鹽性[7]。在擬南芥中研究發現，鹽脅迫下AtKUP2、AtKUP3、AtKUP6、AtKUP12的表達存在不同程度的上調[8]。HAK轉運家族在旱脅迫方面也有重要的作用，在玉米中，存在多種假定的順式作用元件，其中水分脅迫順式元件ACGTATERD1在玉米的HAK基因家族的27個成員中都存在[9]。另外，還有元件ABRERATCAL、Ca2+-responsive element廣泛存在于玉米HAK基因家族的23個成員中[10]。除此之外，還有其他非生物脅迫反應元件存在于大多數的成員中，ABRELATERD1、PRECONSCRHSP70A和SEBFCONSSTPR10A作用于脫水反應[11]。目前，對HAK基因家族的研究主要在擬南芥、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)[10,12-14]中。

葡萄(VitisviniferaL.)是繼擬南芥、水稻和楊樹后完成全基因測序的第4種開花植物，其基因組大約是擬南芥基因組的3～4倍(約為500Mb)。目前，葡萄抗逆相關基因的研究已經比較廣泛，但對于葡萄中的HAK基因家族成員抗逆性研究也未見報道，因此，本研究旨在利用生物信息學的方法進行葡萄HAK基因家族的分離與功能鑒定，進而為葡萄抗逆栽培調控與遺傳改良等方面的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為葡萄‘紅地球’(VitisviniferaL.‘Red Globe’)試管苗，保存于甘肅農業大學果樹生理與生物技術實驗室。將紅地球葡萄試管苗莖段接種于GS固體培養基上，置于LED白光(WLED 424～724 nm，459 nm)的人工氣候箱中培養。培養條件為28 ℃，220 μmol·m-2·s-1光照16 h；23 ℃暗培養8 h。

1.2 試管苗RNA提取

待葡萄試管苗生長至30 d后，選取長勢一致的試管苗，分別用400 mmol·L-1NaCl、50 μmol·L-1ABA和質量分數為10% PEG處理 6 h，每個處理設置3組重復，以蒸餾水處理為對照。處理后取葉片于液氮中速凍，然后置于 -80 ℃冰箱中保存，并用CTAB法提取總RNA。

1.3 葡萄HAK基因家族成員的獲得

下載玉米、水稻和擬南芥HAK基因的CDS序列，在葡萄基因組庫的(http://www.genoscope.cns)Blast-Search中，檢索篩選得到的葡萄HAK基因候選成員。運用DNAMAN軟件，將候選的CDS序列進行比對分析，篩除相似度 >98%的基因，最后得到無重復區段的葡萄HAK基因家族成員的序列。

1.4 葡萄HAK蛋白理化性質的分析

運用ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)獲得葡萄HAK基因家族成員的分子質量大小、理論等電點、編碼蛋白氨基酸數目等基本理化性質；在作圖軟件中進行染色體定位，通過在線軟件SOPMA(NPS@: SOPMA secondary structure prediction)進行二級結構的預測；通過PSORT(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/ form.Html)進行亞細胞定位的預測。

1.5 葡萄HAK基因結構和順式作用元件分析

通過GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對葡萄HAK基因家族成員外顯子的長度和結構進行預測[15]；在NCBI中獲得每個成員的啟動子上游2 kb區域的序列，使用PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在線軟件[16]進行順式作用元件分析；采用TMHMM在線軟件[17](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進行跨膜結構域分析。

1.6 葡萄HAK基因多序列比對和系統發育分析

運用ClustalX 2.1[18]和 MEGE 5.0[19]，使用鄰近法繪制系統發育樹，用DNAMAN對VvHAKs進行多序列比對。

1.7 葡萄HAK基因芯片表達譜分析

從NCBI提供的GEO數據庫中下載葡萄RNASeq數據，登錄號為GSE31594、GSE31662、GSE31675和GSE31677，數據分別是鹽、干旱、低溫、高溫、ABA和水分脅迫下的表達數據。用葡萄LBD核酸序列為探針檢索出序列相同的Affymetrix GeneChip 16 K基因ID，然后提取葡萄LBD基因在各種非生物脅迫下的RNASeq數據，通過Excel對數據進行log2轉換，最后用HemI制作電子表達熱圖(heatmap)。

1.8 實時熒光定量(qRT-PCR)表達分析

應用Bio-Rad iCycler iQ實時定量PCR儀對VvHAKs進行逆境表達分析，使用SYBR GreenⅠ(TaKaRa)試劑盒，以葡萄管家基因UBI為內參基因[20]。擴增體系含1 μL cDNA，上下游引物各0.8 μL(表1)，10.4 μL反應 SYBR MIX， 7 μL ddH2O，總體系20 μL。反應程序為：95 ℃下變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃下退火30 s，40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。反應結束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線?；虻南鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCT計算[21]。

1.9 數據統計與分析

試驗設置3次技術重復，用Excel 2013軟件和SPSS version 22.0軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄HAK基因家族的理化性質和染色體定位

染色體定位分析表明(圖1)：VvHAKs的18個家族成員中，有17個成員分別分布于9條不同的染色體上，VvHAK09的位置未知。其中1號染色體上有5個成員，7號染色體上有4個成員，14號染色體上有2個成員，2、6、12、13、17和19號染色體上各有1個成員。除了7號染色體上的家族成員分布較為集中外，其余成員分布的較為分散，未表現出集中性。位置結構信息表明(表2)，VvHAKs中CDS序列最短的是VvHAK07，為 1 845 bp，最長的是VvHAK04，為2 400 bp，大多數成員的CDS序列長度為2 000～2 500 bp；葡萄HAK基因家族編碼氨基酸個數為614～800；葡萄HAK基因家族中，VvHAK02等電點最小，為7.35，VvHAK18等電點最大，為9.03，大多數成員的等電點主要集中在8～9之間，表明葡萄HAK基因家族的蛋白質呈弱堿性，外顯子數目為7～12個。

2.2 葡萄HAK基因家族的結構分析

葡萄HAK基因家族的外顯子個數為7～12，其中，VvHAK04、VvHAK08、VvHAK15、VvHAK13、VvHAK14、VvHAK16和VvHAK18均含有9個外顯子；VvHAK02、VvHAK06、VvHAK10、VvHAK11和VvHAK12均含有10個外顯子；VvHAK01、VvHAK05和VvHAK09均含有11個外顯子；VvHAK03含有12個外顯子；VvHAK07含有7個外顯子；VvHAK17含有8個外顯子。將葡萄HAK基因家族的18個成員進行聚類并結合外顯子結構分析表明(圖2)，進化關系遠近與外顯子結構分布有關，聚類關系近，外顯子數量相近，如：VvHAK05、VvHAK14、VvHAK15、VvHAK16和VvHAK18，可推測具有相似編碼區結構的成員功能上有一定的相似性。

表1 葡萄HAK基因家族表達分析的實時熒光定量引物Table 1 The primers for qRT-PCR analysis of VvHAKs gene expression

1～18. VvHAK01-VvHAK18

表2 葡萄HAK基因的位置結構信息Table 2 Position structure informations of VvHAKs

圖2 葡萄HAK基因家族的基因結構Fig.2 Gene structures of VvHAKs

圖3 葡萄HAK多序列比對Fig.3 The multiple sequence alignment of VvHAKs

2.3 葡萄HAK基因家族的多序列比對與進化分析

VvHAK07、VvHAK13和VvHAK17這3個基因家族成員之間區段的保守性較低，其余的15個基因家族成員之間區段的保守性較高且在N端附近發現有典型的鉀離子KT/KUP/HAK的保守區域GVVYGDLGTSPLY(圖3)。系統進化樹可將HAK基因家族(圖4)分為7個亞族，其中VvHAKs成員分布為：第1亞族中有4個成員，包含VvHAK02、VvHAK06、VvHAK08和VvHAK09；第2亞族中5個成員，包含VvHAK01、VvHAK03、VvHAK04、VvHAK11和VvHAK13；第3亞族中有3個成員，分別為VvHAK01、VvHAK11和VvHAK13；第4亞族中只有VvHAK10；第5亞族中僅有VvHAK17；第6亞族中有2個成員，為VvHAK07和VvHAK12；第7亞族中有5個成員，包括VvHAK05、VvHAK14、VvHAK15、VvHAK16和VvHAK18。

圖4 擬南芥、玉米、水稻和葡萄HAK基因進化樹Fig.4 Phylogenetic tree using the HAK amino acid sequence from grape,Arabidopsis,rice and maize

2.4 葡萄HAK基因家族編碼蛋白Motif分析

Motif分析HAK基因家族的18個成員，得出有15個基序(圖5)。Motif分析表明：VvHAKs中GroupⅠ的5個成員，VvHAK14、VvHAK15和VvHAK18有15個基序，VvHAK05不含Motif 15，VvHAK07不含Motif 11和Motif 12，整個GroupⅠ在 N端的保守性很高，結合聚類分析和外顯子分析結果可推測，這5個成員在功能上具有相似性；GroupⅡ的9個成員，除VvHAK13外，其余8個成員在N端具有較高的保守性，具有較多相似的基序，推測這類亞組的成員執行功能相似；Group Ⅲ的VvHAK10和VvHAK12具有14個基序，沒有Motif 15，VvHAK07不具有Motif 2、Motif 5、Motif 7和Motif 15，N端的保守性不高，與多序列比對結果一致。Group Ⅳ的2個成員，其中VvHAK07不具有Motif 7和Motif 15。由此可以得出：Motif 15為GroupⅠ中家族成員特有的基序，基序所表達的保守程度同多序列比對分析得出的結論一致。

2.5 葡萄HAK基因家族的二級結構分析和亞細胞定位

葡萄HAK基因家族編碼蛋白質的二級結構主要以α-螺旋和不規則卷曲為主，成員跨膜區域數為9～14個(表3)。亞細胞定位結果表明(表4)，葡萄HAK基因家族的18個成員在細胞質膜上均有表達，且表達量較高，這與其主要作為鉀離子轉運子參與K+吸收的功能是一致的；在細胞質和過氧化物酶體中幾乎沒有表達。但是VvHAK06在細胞質中的表達量高于在細胞質膜上的表達，推測此蛋白可能位于細胞質上；VvHAK08和VvHAK16這2個成員在細胞質和質膜上都有表達，推測這2個家族成員的蛋白在細胞質和質膜均有定位，剩余的15個VvHAKs成員則主要在質膜上表達。

蛋白Proteinα-螺旋/%Alpha helixβ-轉角/%Beta turn不規則卷曲/%Random coil跨膜區域數目Numbers of transmembrane regionsVvHAK0144.719.5223.4111VvHAK0235.519.7929.5013VvHAK0333.899.4427.5912VvHAK0436.508.8827.2514VvHAK0542.119.7623.5311VvHAK0637.799.3826.9012VvHAK0740.239.1226.389VvHAK0840.149.6626.9413VvHAK0937.929.8927.4112VvHAK1036.429.0126.3414VvHAK1136.399.5925.9511VvHAK1243.918.3425.8512VvHAK1343.457.9523.8611VvHAK1436.819.6225.0012VvHAK1536.759.3225.7012VvHAK1637.569.7727.6312VvHAK1740.1911.9925.5510VvHAK1837.1910.2225.3412

表4 葡萄HAK基因亞細胞定位預測Table 4 Subcellular location prediction of VvHAKs

注：- 表示無表達；Cyto代表細胞質；E.R代表內質網；Chol代表葉綠體；Mito代表線粒體；Vacu代表液泡膜；Plas代表細胞質膜；Nucl代表細胞核；Extr代表細胞基質；Pero代表過氧化物酶體；表內的數值代表準確率，分值越高，代表預測的準確性越高。

Note:- represents no expression; Cyto represents cytoplasm; E.R represents endoplasmic reticulum; Chol represents chloroplast; Mito represents mitochondria; Vacu represents tonoplast; Plas represents membrane; Nucl represents nucleus; Extr cells represent the matrix; Pero represents peroxisome; numerical representation form accuracy rate,the higher the score,the higher the accuracy of predicted.

2.6 順式作用元件分析

對葡萄HAK基因家族的順式作用元件進行分析表明(表5)，VvHAKs中GroupⅠ的5個成員VvHAK05、VvHAK14、VvHAK15、VvHAK16和VvHAK18均存在ABA響應元件，其中VvHAK16還存在DRE和LTRE元件，說明葡萄HAK GroupⅠ的功能可能與ABA信號轉導相關。VvHAKs中GroupⅡ的9個成員，分別為VvHAK01、VvHAK02、VvHAK03、VvHAK04、VvHAK06、VvHAK08、VvHAK09、VvHAK11和VvHAK13，它們均含有LTRE元件，與GroupⅡ在植物體內參與植物生理活動的規律一致，其中VvHAK04、VvHAK08、VvHAK09、VvHAK11和VvHAK13含有ABA和DRE響應元件，說明葡萄HAK基因家族GroupⅡ的功能除了參與植物生理作用外，可能參與信號轉導。VvHAKs中GroupⅢ的VvHAK12不存在ABA響應元件、DRE和LTRE元件，只與轉錄因子的結合位點相關；GroupⅣ的VvHAK17中只有ABA響應元件，可能參與ABA信號轉導。葡萄HAK基因上游2 kb區域所包含的順式作用元件因所屬亞族的不同，使元件表達具有差異性。同時發現，所有成員上游2 kb區域均存在MYB和WRKY轉錄因子的結合位點，說明VvHAKs的表達與MYB和WRKY轉錄因子作用密切相關，并且這些順式作用元件可能單個發揮作用，也可能共同參與葡萄HAK基因家族的表達。

2.7 葡萄HAK基因芯片表達譜分析

對葡萄HAK基因芯片表達譜進行表達分析(VvHAK11除外)，結果顯示，葡萄HAK基因家族在受到鹽、干旱、低溫、高溫、ABA及水分脅迫等非生物脅迫時，基因表達水平變化顯著(圖6)。VvHAK06在響應水分脅迫時表達量明顯上調，而VvHAK17明顯下調；VvHAK01、VvHAK15和VvHAK18在響應高溫脅迫時表達量明顯上調，而VvHAK06則呈現先下調再上調的趨勢；VvHAK09和VvHAK13在響應高溫脅迫時表達量呈現先上調再下調的趨勢；VvHAK04、VvHAK06、VvHAK07、VvHAK08和VvHAK12在響應鹽、干旱、高溫脅迫下的表達量呈上調趨勢。VvHAK17在響應鹽、干旱脅迫時的表達量呈現先下調再上調的趨勢。VvHAK10在響應低溫脅迫時表達量呈現明顯上調趨勢，VvHAK15和VvHAK18在響應干旱和低溫脅迫處理后呈現下調表達。葡萄HAK基因家族對ABA脅迫的響應不明顯。

表5 葡萄HAK基因順式作用元件的分布Table 5 Distribution patterns of VvHAKs cis-acting elements

圖中用紅色、白色、藍色代表基因表達水平。藍色表示基因表達弱，紅色表示基因表達強 Red,white and blue are used to represent gene expression levels.Blue indicates weak gene expression,red indicates strong gene expression

圖6 葡萄HAK基因表達譜
Fig.6 Expression profile ofHAKgenes in grape

2.8 葡萄HAK基因家族成員在非生物脅迫下的表達分析

葡萄HAK基因家族在ABA、PEG和NaCl 3種脅迫下的表達量具較顯著差異(圖7)。VvHAK01、VvHAK05在50 μmol·L-1ABA處理6 h后，葉片表達量明顯下調，其余均為上調；其中，VvHAK04、VvHAK06、VvHAK08、VvHAK09、VvHAK10、VvHAK13和VvHAK15同時在50 μmol·L-1ABA 和10% PEG處理 6 h后上調；VvHAK06、VvHAK07、VvHAK09、VvHAK10、VvHAK11和VvHAK13在50 μmol·L-1ABA 和400 mmol·L-1NaCl處理6 h后上調。VvHAK01、VvHAK02、VvHAK03、VvHAK04、VvHAK05、VvHAK08、VvHAK14、VvHAK15、VvHAK16、VvHAK17和VvHAK18在400 mmol·L-1NaCl處理6 h后葉片表達量明顯下調，說明6 h內，鹽脅迫在一定程度上抑制基因的表達。VvHAK03、VvHAK05、VvHAK07、VvHAK11、VvHAK14在10 % PEG處理6 h后葉片表達量下調，可能與其不存在順式作用元件DRE有關，同時VvHAK03、VvHAK05和VvHAK14在400 mmol·L-1NaCl處理6 h后，葉片表達量明顯下調，說明400 mmol·L-1NaCl抑制VvHAK03、VvHAK05和VvHAK14基因的表達。

3 討 論

植物在發育過程中進化出一套保護機制，以此來應對干旱、高鹽、溫度和氧化等逆境脅迫。在這些不利因素下，植物可以通過啟動相關基因的轉錄，形成具有不同功能的蛋白來保護細胞內的各種新陳代謝反應，進而維持植物體結構與功能的完整性[22]。

HAK轉運體家族首次發現于細菌中[23]，現已在植物中發現4個主要的鉀離子轉運基因家族，其中KUP/HAK/KT轉運子家族是最大的基因家族[3]。本研究共得到18個葡萄HAK家族成員，Motif 分析將葡萄HAK基因家族分為4個亞族，VvHAKs成員主要以GroupⅠ和GroupⅡ為主，GroupⅢ和GroupⅣ中的成員相對較少。系統發育樹中葡萄HAK的家族成員與擬南芥HAK基因家族成員有較高的同源性，且發現同一物種間的成員在進化樹中分布較為集中，玉米HAK和水稻HAK這兩個家族成員之間同源性較高。

已有研究表明：結構上存在數目不等的跨膜域，并且N端具有相對保守區域，是KUP/HAK/KT基因家族的共同特征；多序列比對發現VvHAKs的大多數成員在N端有相對保守區域，而且二級蛋白結構分析發現整個葡萄HAK家族均有至少9個跨膜區域，這與玉米基因家族二級結構分析類似[10]，VvHAKs外顯子數目和結構在不同亞族間差異很大，但同一亞族中編碼區結構類似，這一規律與大豆HAK家族中的類似[24]。染色體定位表明，除了第7條染色體上的4個成員分布比較集中以外，其余8條染色體上的成員的分布相對分散，整體未表現出集中性。亞細胞定位結果表明，VvHAKs主要是在質膜上表達，這與其作為鉀離子轉運體的功能是一致的[24]，且這個結果與林煙草中HAK基因的亞細胞定位研究結果相同[25]。在玉米和水稻中的多數成員中存在ABRE作用元件，這些作用元件可能會在信號轉導中起著重要的作用，而ABA在生物體內最主要的功能是作為激素參與植物對外界脅迫的適應。在植物對非生物脅迫應答中，脅迫誘導基因的表達存在ABA依賴途徑，在這些基因的啟動子區域有一些保守的ABA反應元件，ABRE作用元件對一些受ABA誘導的抗逆基因的表達起調控作用，對基因響應ABA誘導至關重要[26]。

芯片表達譜分析表明，30 ℃高溫條件下，VvHAK01、VvHAK15和VvHAK18的表達量最高，表明其對葡萄漿果成熟具有正調控作用；VvHAK06在響應水分、高鹽、干旱及高溫脅迫時，在葡萄莖尖和葉片組織中的表達呈現明顯的上調表達趨勢。定量分析表明，在不同脅迫下葡萄HAK基因家族成員在葉片中的表達程度不同。VvHAK13在50 μmol·L-1ABA、10% PEG處理6 h后，葉片表達量顯著上調；VvHAK05在50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl、10 % PEG處理6 h后，葉片表達量顯著下調；與芯片表達譜分析一致。VvHAK07和VvHAK09在50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl處理6 h后顯著上調；VvHAK09的表達與芯片表達譜分析一致。VvHAK01、VvHAK05在50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl處理6 h后顯著下調；與芯片表達譜分析一致。VvHAK03、VvHAK05和VvHAK14在 400 mmol·L-1NaCl、10 % PEG處理6 h后顯著下調；VvHAK05和VvHAK14與芯片表達譜分析一致。擬南芥鹽脅迫后AtHAK06和AtHAK11的表達顯著增加，而AtKUP02的轉錄則顯著下降，在低鹽的脅迫下AtHAK05和ThHAK05都受到Na+的抑制[27]，HvHAK1和NrHAK1在100 mmol·L-1NaCl處理后表達上調，鹽脅迫對SeHAK1轉錄水平的影響因鹽角草的發育時期以及鹽脅迫處理時間和濃度的不同而異[28]。葡萄HAK基因家族中的11個成員在高鹽脅迫后，葉片的表達量下調，有可能是HAK基因家族在葡萄葉片中表達較少或者是在生長期表達量低，也可能是400 mmol·L-1NaCl濃度超過葡萄HAK基因家族耐鹽程度。植物生長過程中基因表達水平的變化實質上是受到植物激素的調節。在實時熒光定量分析中葡萄HAK基因家族成員的表達均受ABA調節，表明ABA對HAK/KUP/KT基因的表達可能具有調控作用。

圖7 葡萄HAK基因家族在不同處理下的相對表達水平Fig.7 Relative expression of VvHAKs under different treatments