日本結縷草Zj ERF 1的克隆、轉錄激活活性、亞細胞定位及表達分析

滕珂，張蕊，檀鵬輝，岳躍森，范希峰，武菊英*

(1.北京草業與環境研究發展中心，北京100097;2.北京林業大學草坪研究所，北京100083)

植物為適應在生長發育過程中遭受到的多種生物脅迫及非生物脅迫，進化出了復雜的分子調控機制[1]。轉錄因子是一類能夠結合啟動子作用元件的DNA結合蛋白，通過激活或抑制相關基因的轉錄來發揮功能[2]。AP2/ERF轉錄因子家族以APETALA2(AP2)結構域來命名，是植物中最大的一類轉錄因子家族之一，廣泛參與DNA結合。根據所含AP2結構域的數量，AP2/ERF轉錄因子可以分為AP2、RAV和ERF(ethylene responsive factor，乙烯響應元件結合蛋白)等類型[3]。AP2轉錄因子含有兩個AP2結構域，主要在花的發育和形態建成過程中起作用。RAV轉錄因子包含一個AP2/ERF結構域和一個B3結構域，參與植物生長發育和非生物脅迫應答[4]。ERF轉錄因子只含有一個AP2結構域，根據其結合的位點可分為兩類:一類通過結合靶基因的GCC-box來對其轉錄進行調控，參與乙烯(ET)、茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)等激素的信號轉導途徑;另一類通過結合CCGAC位點參與多種非生物脅迫途徑[5-6]。

目前，前人已經在擬南芥(Arabidopsis thaliana)[6]、水稻(Oryza sativa)[7]、柑橘(Citrus reticulata)[8]和菜心(Brassica campestris)[9]等多種植物中克隆并鑒定出了ERF轉錄因子，并對其功能展開了深入研究。擬南芥AtERF 7結合GCC-box抑制下游基因的轉錄，減弱了保衛細胞對ABA的敏感性，提高了植物細胞的保水能力[10]。水稻OsERF 922可通過調控ABA合成相關基因的表達來調節內源ABA的含量，從而改變水稻對鹽脅迫的適應能力[11]。柑橘Cit ERF 13通過結合Cit PPH啟動子的DRE(dehydration-responsive element，干旱響應元件)來調控其表達，促進葉綠素降解[8]。進一步研究揭示了Cit ERF13可通過抑制葉綠素合成、CO2羧化作用等多種途徑抑制光合效率[12]。菜心Br ERF72是一種可受MeJA(methyl jasmonate，茉莉酸甲酯)誘導，細胞核定位且具有轉錄激活活性的轉錄因子，可通過直接結合Br LOX4、Br AOC3和Br OPR3啟動子的GCC或DRE/CRT(C-repeat，C重復元件)來參與JA合成途徑，進而調控植物葉片衰老[9]。

結縷草(Zoysia japonica)是一種重要的暖季型草坪草，因其耐踐踏、抗旱性強、耐鹽等優點而廣泛應用于運動場草坪的建植及城市綠化[13-14]。然而，目前結縷草的遺傳資源研究仍十分有限，在GenBank中僅有500多條EST(expressed sequence tags，表達序列標簽)序列[15]。深入挖掘結縷草優良的基因資源，不僅可以增強對結縷草抗逆分子機理的認識，而且有助于結縷草性狀改良育種。雖然已經從一些模式植物中克隆得到ERF基因，但是ERF在結縷草中的功能研究還鮮有報道，其功能并不清楚。本研究利用RACE(rapid amplification of cDNA ends，c DNA末端快速克隆)技術首次從日本結縷草中克隆得到Zj ERF 1基因，同時利用染色體步移方法對其啟動子進行了克隆，并對ZjERF 1基因與其啟動子進行了生物信息學分析;研究了ZjERF1的轉錄激活活性和亞細胞定位特征，并分析了激素及鹽、干旱脅迫處理后ZjERF 1基因的表達情況，旨在為深入研究Zj ERF 1基因的功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的日本結縷草品種‘Meyer’由江蘇省中國科學院植物研究所劉建秀研究員惠贈，種植于溫室，農桿菌EHA105、亞細胞定位載體3302Y3、酵母雙雜交載體pGBKT7、Y2HGold酵母菌株及本生煙草(Nicotiana benthamiana)均由本實驗室保存。RACE試劑盒、反轉錄試劑盒、BglⅡ快切酶、Bam HⅠ快切酶、p MD-19T、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、Infusion連接酶和酵母缺陷型培養基等購于寶生物公司(Ta KaRa)。RNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒購自OMEGA公司。大腸桿菌感受態DH5α購于天根生化科技公司。PCR Mix、SYBR Mix購自康為世紀公司。PEG4000、乙烯(ET)、脫落酸(ABA)和茉莉酸甲脂(MeJA)購于SIGMAALDRICH。

1.2 方法

1.2.1 Zj ERF 1克隆與生物信息學分析 利用試劑盒提取健康生長的日本結縷草葉片RNA。根據前期轉錄組數據設計5′/3′RACE的引物(表1)，按照RACE試劑盒說明書進行5′/3′RACE。反應結束后經瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR產物純化后連接克隆載體p MD-19T，檢測為陽性的菌液送北京睿博興科生物技術有限公司測序，利用DNAMAN 8.0拼接測序結果。根據拼接序列設計引物ZjERF1-F/R，以日本結縷草cDNA為模板擴增基因全長，反應程序為95℃10 min;95℃30 s，57℃30 s，72℃45 s，30個循環;72℃5 min，12℃保溫。目的片段純化后連接克隆載體，檢測后測序，測序正確的菌液提取質粒用于后續實驗。

利用DNAMAN 8.0軟件預測基因編碼的氨基酸序列。保守結構域分析及同源比對利用NCBI的Blast功能，用CLUSTALW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)和BoxShade(https://embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html)在線軟件作圖。蛋白質的親疏水性、分子量及等電點推導用ProtParam。信號肽預測使用SignalP 4.1。系統進化樹利用MEGA 5.0軟件構建。亞細胞定位情況預測用Softberry網站。

表1 引物列表Table 1 Primer list of this study

1.2.2 ZjERF 1啟動子克隆與作用元件預測分析 CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide，溴化十六烷基三甲銨)法提取健康生長的日本結縷草葉片DNA，根據ZjERF 1基因gDNA序列的5′端設計染色體步移的3條特異性引物SP1、SP2、SP3(表1)，以日本結縷草基因組DNA為模板進行染色體步移，反應結束后將2、3輪產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一的PCR產物送去測序。根據染色體步移測序結果設計引物ZjERF1-Pro-F/R(表1)擴增啟動子序列，反應程序為95℃10 min;95℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，30個循環;72℃5 min，12℃保溫，PCR產物純化后連接p MD-19T載體，陽性菌液送測序。通過PLACE網站(https://sogo.dna.affrc.go.jp)預測Zj ERF 1基因啟動子可能存在的作用元件。

1.2.3 ZjERF1轉錄激活活性驗證 以測序正確的p MD-ZjERF1質粒為模板，BD-ERF1-F/R為引物(表1)，用PrimeSTAR進行PCR擴增，反應程序為98℃10 s，98℃10 s，68℃30 s，25個循環;72℃3 min，12℃保溫。利用Bam HⅠ單酶切p GBKT7載體，PCR儀中反應15 min。將PCR產物及載體單酶切產物進行純化，之后在In-Fusion連接酶的作用下進行同源重組。連接產物轉化DH5α，挑取單克隆送公司測序，測序正確的菌液提質粒，保菌備用。利用Li AC(lithium acetate，醋酸鋰)法[16]，將pGBKT7-ZjERF1轉化為酵母感受態細胞，涂布于一缺培養基(SD-Trp)，30℃培養2 d左右。挑取單克隆，PCR鑒定為陽性的菌液，以p GBKT7空載體為對照，分別稀釋10、100倍上樣，利用Cannon EOS 60D拍照。

1.2.4 Zj ERF1亞細胞定位 設計亞細胞定位載體構建引物3302Y3-ERF1-F/R(表1)，以含有目的基因的質粒為模板擴增目的條帶，用In-Fusion連接酶將PCR純化產物連接入BglⅡ單酶切過的3302Y3載體。構建好的亞細胞定位載體35S::Zj ERF1:YFP轉化農桿菌EHA105。采用瞬時表達的方法，將成功轉化目的質粒的農桿菌注射本生煙草葉片，暗培養48 h[17]。以3302Y3空載體為對照，利用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP-5)觀察YFP熒光在細胞中的分布情況。

1.2.5 ZjERF 1的表達分析 剪取正常生長的日本結縷草成熟植株的根、莖、葉做組織差異分析;剪取幼嫩葉片、成熟葉片、衰老葉片，做不同發育時期的表達分析。選取5盆長勢一致的日本結縷草分別噴施200μmol·L-1ET、10μmol·L-1ABA、10μmol·L-1MeJA，澆灌300 mmol·L-1NaCl和20%PEG4000。在處理第0、1、3、6、12、24 h分別剪取不同處理的葉片，液氮速凍后-80℃保存。提取上述樣品總RNA，經NanoDrop ND-1000檢測合格后反轉錄為cDNA。設計熒光定量引物qERF1-F/R(表1)，以日本結縷草Actin基因(GenBank登錄號:GU290546)為內參進行qRT-PCR反應，每個樣品設置3個生物學重復，4個技術重復。用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量[18]。

1.3 數據統計與分析

利用Excel 2010計算表達量，SPSS 18.0進行方差分析，SigmaPlot 12.5作圖。

2 結果與分析

2.1 Zj ERF 1全長的獲得與生物信息學分析

通過RACE方法從日本結縷草中克隆得到目的基因，命名為Zj ERF 1(圖1)。該基因開放閱讀框為630 bp，編碼209個氨基酸(GenBank登錄號:MH294481)。保守結構域分析表明，該基因編碼的蛋白屬于ERF轉錄因子家族。氨基酸序列同源比對結果顯示，ZjERF1與玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)及水稻同源性均在80%以上(圖2A)。一級結構分析表明，該基因編碼蛋白分子量為22.48 k D;理論等電點為5.0，其中陰性氨基酸(Asp+Glu)29個，陽性氨基酸(Arg+Lys)21個;親水性平均系數為-0.285，屬于親水性蛋白。信號肽預測結果表明，ZjERF1不含信號肽;構建系統進化樹發現，ZjERF1與粳稻(Oryza sativa)AP2/ERF-like(BAD 19440.1)親緣關系最近(圖2B)。亞細胞定位預測結果顯示，ZjERF1定位于細胞核。

2.2 Zj ERF 1啟動子的克隆與作用原件分析

染色體步移結束后，將2、3輪PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3A)，條帶清晰的PCR產物送公司測序，測序結果經比對分析，最終獲得Zj ERF 1基因ATG上游1581 bp序列。根據得到的序列設計引物擴增Zj ERF 1啟動子，得到目的條帶與預期相符，經測序分析確定為Zj ERF 1啟動子序列。PLACE啟動子在線預測分析發現，Zj ERF 1啟動子序列中除了有CAAT-box、TATA-box等基本順式作用元件，還含有與光、植物激素等相關的順式調控元件。該序列上有1個脫落酸響應元件(ABRE:ABA-responsive element，茉莉酸響應元件)，8個茉莉酸甲酯響應元件(4個CGTCA-motif，4個TGACG-motif)和1個水楊酸響應元件。此外，還有HSE(heat shock element，熱休克元件)、MBS(MYB binding site，MYB轉錄因子結合位點 )、LTR(low-temperature responsiveness，低溫響應元件)和TC-rich repeat等若干與非生物脅迫關的應答元件(圖3B)。

圖1 Zj ERF 1基因的克隆Fig.1 Cloning of Zj ERF 1 gene

圖2 Zj ERF 1同源性比對及遺傳進化分析Fig.2 Sequences alignment and phylogenetic analysis of Zj ERF1

圖3 啟動子克隆的染色體步移及其作用元件分析Fig.3 Genome walking for isolating promoter and cis-elements analysis

2.3 ZjERF1轉錄激活活性分析

盡管大量研究發現AP2/ERF家族的轉錄因子具有轉錄激活或轉錄抑制的作用，而ZjERF1的轉錄活性特征并不清楚。為分析ZjERF1是否具有激活活性，將構建成功的p GBKT7-ZjERF1載體轉化Y2 HGold酵母感受態細胞，以p GBKT7空載體為對照。結果顯示，在SD-Trp培養基上對照和p GBKT7-Zj ERF1均可正常生長。之后，將成功轉化目的質粒的菌液分別稀釋1、10和100倍后點樣在SD-Trp-His-Ade培養基上觀察其生長情況。結果表明，對照不能在SD-Trp-His-Ade培養基上生長，而p GBKT7-ZjERF1可正常生長。本試驗表明:ZjERF1具有較強的自激活活性(圖4)。

圖4 Zj ERF1轉錄激活驗證Fig.4 Auto-transcriptional activation assay

2.4 ZjERF1亞細胞定位

亞細胞定位預測結果顯示，Zj ERF1定位于細胞核，為了進一步研究ZjERF1的定位情況，構建35S::ZjERF1:YFP載體，以空載35S::YFP為對照，質粒成功轉化農桿菌后注射本生煙草葉片，48 h暗培養后在Leica SP-5激光共聚焦顯微鏡下觀察黃色熒光蛋白分布(yellow fluorescence protein，YFP)，結果發現，轉35S::YFP的熒光信號分布于整個細胞中，而ZjERF1定位于細胞核(圖5)。

圖5 ZjERF1的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of ZjERF1

2.5 Zj ERF 1表達模式分析

熒光定量結果顯示，Zj ERF 1在根、莖、葉中均有表達，但在莖中的表達量顯著高于根和葉片，分別是根中的2.37倍，葉片中的1.77倍(圖6A);Zj ERF 1在不同發育時期的葉片中表達量也明顯不同，與衰老程度呈正相關性，其在衰老葉片中的表達量最高，幼嫩葉片中的表達量最低。其中衰老葉片的表達量分別是成熟葉片的1.41倍，幼嫩葉片的2.59倍(圖6B)。

ET、ABA及MeJA激素處理后的熒光定量結果表明:ZjERF 1的表達可以受到ET的誘導，在處理的第6 h達到最高水平，為初始水平的5.12倍(圖6C);Zj ERF 1的表達在噴施ABA后的前3 h呈下降趨勢，但在處理的第6 h表達量顯著升高，為第3 h的20.0倍，之后又表現出顯著下降的趨勢(圖6D);Zj ERF 1的表達總體上受到MeJA的誘導，在處理6 h達到峰值，為初始水平的2.31倍(圖6E)。

高鹽和干旱脅迫處理后的熒光定量數據顯示:在處理的24 h內，300 mmol·L-1的NaCl處理誘導了Zj ERF 1的表達，具體表現為在第3 h開始升高，為第1 h的1.39倍，而在第12 h達到峰值，為處理前的3.99倍(圖6F)。而20%的PEG4000處理顯著抑制Zj ERF 1的表達，表達量隨著處理時間的延長逐漸下降，在6 h達到最低值，為初始水平的1.47×10-3倍(圖6G)。

3 討論

目前關于ERF基因的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物中，在結縷草上的研究卻鮮有報道。本研究利用RACE的方法從日本結縷草中克隆得到ZjERF 1基因，蛋白保守結構域分析表明，ZjERF 1屬于ERF轉錄因子家族。Zj ERF 1擁有1個高度保守的含有65個氨基酸殘基的AP2 DNA結構域，具有高度結合GCC-box的潛力，能夠調控相關基因的表達[6]。構建系統進化樹發現ZjERF1與粳稻AP2/ERF-like(BAD19440.1)的親緣關系最近。擬南芥中的研究發現，EAR motif對于ERF轉錄因子發揮轉錄抑制的作用至關重要[19]。本研究轉錄激活活性分析表明，ZjERF1具有較強的轉錄激活活性，可以發揮轉錄調控的功能，分析這可能與其不含EAR-motif有關。亞細胞定位結果顯示，ZjERF1定位于細胞核，這與柑橘CitERF13[20]、小麥(Triticum aestivum)TaERF W17[21]、菜心Br ERF72[9]的定位結果一致。以上結果表明:ZjERF1屬于典型的ERF轉錄因子，具有轉錄激活活性，定位于細胞核，可調控下游相關基因的表達，能夠參與多種轉錄調控過程。

圖6 Zj ERF 1表達特征分析Fig.6 Real-time quantitative PCR of Zj ERF1 expression characters

啟動子作為基因的組成部分，控制轉錄起始的過程，它在一定程度上決定了基因表達的時間、部位及強度，啟動子的研究是基因表達調控研究的基礎[22]。作用元件是RNA聚合酶直接結合的區域，對啟動子的活性影響顯著[23]。前人研究表明，不同植物中的ERF轉錄因子可同時響應茉莉酸、脫落酸、非生物脅迫等因素的調節[9，24]。本研究通過染色體步移的方法獲得了Zj ERF 1基因ATG上游1581 bp序列，分析發現，該序列上除了含有TA-TA-box、CAAT-box等基本作用元件以外，還存在著多個響應MeJA、ABA和非生物脅迫誘導(干旱、熱、冷)的作用元件。據此推斷Zj ERF 1是一個非常重要的轉錄因子，可同時參與激素信號傳導和響應非生物脅迫過程，并在其中行使著不同的功能，值得深入開展研究。此外，啟動子作用元件分析預測Zj ERF 1可受MeJA等激素和非生物脅迫的調節，為進一步研究ZjERF 1的表達特征提供了依據。

不同組織熒光定量結果顯示，Zj ERF 1在根、莖、葉中均有表達，其中莖中的表達量顯著高于其在根和葉片中的表達量，這與擬南芥AtRAP 2.6的表達特征一致[24]。不同發育時期的葉片熒光定量結果表明，Zj ERF 1在衰老葉片中的表達量最高，這與菜心BrERF 72的研究結果一致[9]。植物葉片的衰老與乙烯的合成密切相關，而ERF作為乙烯途徑中的一個關鍵轉錄因子，在葉片衰老過程中發揮著重要功能[25-26]。本研究發現噴施ET可誘導Zj ERF 1的表達，這與ORA 59的表達情況一致[27]。這表明Zj ERF 1可響應乙烯信號，推測可以在乙烯調控的一系列信號轉導過程中發揮轉錄調控功能。研究表明ABA是一種促衰老激素，外源ABA可以誘導衰老相關的基因的表達[28]。本研究發現ABA可調控Zj ERF 1基因的表達，這與擬南芥AtRAP 2.6[24]和檉柳(Tamarix hispida)Th ERF 7[29]的表達情況一致，說明Zj ERF 1可參與ABA調節的葉片衰老過程。菜心中的研究結果表明，BrERF 72可受JA的誘導，并通過直接結合JA合成基因的啟動子來調節JA的合成，證明了ERF可參與JA調節的葉片衰老[9]。本研究中發現Zj ERF 1啟動子含有多個響應MeJA的作用元件，并且MeJA處理顯著誘導ZjERF 1的表達，因此Zj ERF 1可能參與了調控植物衰老的進程，需要進一步的研究挖掘下游靶基因。此外，我們還發現Zj ERF 1的表達在NaCl處理的第12 h急劇升高，這與Th ERF 7的表達情況類似;而Zj ERF 1的表達在PEG處理的24 h內始終表現出受抑制的趨勢，與Th ERF 6的情況一致[29]。以上分析說明Zj ERF 1的表達可受多種條件的調控，推測其在激素信號傳導和非生物脅迫中發揮著不同的作用。

4 結論

日本結縷草Zj ERF 1基因開放閱讀框為630 bp，編碼209個氨基酸。保守結構域分析表明，Zj ERF 1屬于ERF轉錄因子家族。同時，通過染色體步移的方法得到Zj ERF 1基因ATG上游1581 bp的啟動子序列，該序列含有多個響應MeJA及非生物脅迫的作用元件。轉錄激活分析表明，Zj ERF1具有較強的轉錄激活活性。亞細胞定位結果顯示，ZjERF1定位于細胞核。熒光定量數據表明，Zj ERF 1在衰老葉片中的表達量最高，且Zj ERF 1的表達受ET、MeJA及鹽和干旱處理的調節。本研究表明Zj ERF 1可響應多種因素的調節，并在激素信號傳導和非生物脅迫中發揮著不同的作用，為進一步探索Zj ERF 1基因的功能及其轉錄調控機制奠定了基礎。