單一和復合乳酸菌添加劑對扁穗牛鞭草青貯品質的影響

李小鈴，關皓，帥楊，李小梅，彭安琪，李昌華，蒲棋，閆艷紅，張新全

(四川農業大學動物科技學院，四川 溫江611130)

‘雅安’扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa cv.Ya’an)為禾本科多年生優質牧草，鮮干草產量高，品質優良，再生力與適應性強，南方地區種植面積較大，牛、羊、兔、魚等均喜食，刈割放牧皆可，應用范圍廣[1]。扁穗牛鞭草在夏季生長旺盛，鮮草往往過剩，由于南方地區夏季往往多雨潮濕，干草調制不易成功，而青貯受氣候因素影響小，其不僅可以保留牧草的營養成分，還能提高適口性和利用率，是解決飼草生產季節性不均衡的有效手段[2]。傳統的青貯發酵方法由于營養損失高和飼喂價值低等問題使得優質青貯飼草料的供應日趨緊張，不能滿足我國草食家畜業快速發展的需求[3]。因此，多元化地開發適口性高，營養豐富的優質青貯飼草料，對于緩解冬季飼草短缺，優質青貯飼草料缺乏等問題具有重要意義。

有研究表明，飼草表面附著有害微生物的種類和數量遠遠大于乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)，如讓其自然發酵，青貯效果往往不理想[4]。乳酸菌添加劑的使用是現在國際上主流的一種調制青貯的方法，添加乳酸菌能促進牧草良好的發酵且青貯中的乳酸菌種類與最終發酵品質存在一定關聯[5-6]。但并非所有的商業乳酸菌添加劑都適用于任何一種情況下的青貯。Ando等[7]表明，通過實驗篩選出的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus NGRI 0110)相比于商業植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)能更加有效地提高羊草(Leymus chinensis)青貯品質。而另一項研究發現，盡管由植物乳桿菌和屎腸球菌(Enterococcus faecium)組成的商業乳酸菌添加劑和由植物乳桿菌、深紅沙雷氏菌(Serratia rubidaea)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)以及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)組成的商業乳酸菌添加劑均能改善全株高粱(Sorghum bicolor)青貯發酵，但2種添加劑對高粱青貯有氧穩定性的影響是不同的[8]。因此，篩選適合用于特定地區或材料青貯的乳酸菌成了目前研究的熱點。Avila等[9]將從甘蔗(Saccharum officinarum)青貯中篩選出的植物乳桿菌、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)和布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)添加到甘蔗中評價其青貯效果，最終發現它們都提高了甘蔗青貯中乳酸菌的數量并減少了乙醇的產生。Zhang等[10]將從羊草青貯中篩選出的植物乳桿菌(L.plantarum NG2)添加到羊草中檢驗其效果，結果表明，它可以增加乳酸的含量并降低p H值、丁酸、氨態氮以及酵母菌和霉菌的數量，從而提高羊草發酵品質。

此外，不同乳酸菌具有不同的功能。當不同類型乳酸菌按照一定比例復配在一起時，其協同作用也各不相同。在Filya[11]的研究中，單獨添加布氏乳桿菌或將其與植物乳桿菌結合，均改善了低干物質含量條件下玉米(Zea mays)和高粱青貯的有氧穩定性，但相比于單一布氏乳桿菌，復配組合還能降低氨態氮含量和發酵損失。而Arriola等[12]的研究表明，單獨添加4×105CFU·g-1布氏乳桿菌40788(L.buchneri 40788)比添加1×105CFU·g-1的戊糖片球菌12455(P.pentosaceus 12455)和4×105CFU·g-1的布氏乳桿菌40788(L.buchneri 40788)的復合菌劑更能提高玉米青貯品質。Cai等[13]的研究也表明，7×104CFU·g-1的副干酪乳桿菌(L.paracasei)和3×104CFU·g-1乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)復合添加劑的作用效果不如單獨添加1×105CFU·g-1的副干酪乳桿菌(L.paracasei)。這表明單一和復合乳酸菌添加劑的作用效果尚無明確判定，且不同乳酸菌種類及復配比例下的復合乳酸菌添加劑作用與效果也不同。

因此，本試驗研究由實驗室前期篩選出的3株耐高溫乳酸菌“戊糖片球菌(P.pentosaceus，PP04)”“食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria，WC10)”和“植物乳桿菌(L.plantarum，LP694)”組成的單一和復合乳酸菌添加劑對‘雅安’扁穗牛鞭草青貯的影響，篩選出最適合牛鞭草青貯的乳酸菌添加劑，為南方高溫高濕地區調制優質牛鞭草青貯飼料提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料為四川農業大學崇州基地(N 30°33′，E 103°38′)種植的‘雅安’扁穗牛鞭草。戊糖片球菌、食竇衛斯氏菌和植物乳桿菌為實驗室從中國西南高溫高濕地區青貯中篩選得到。所述戊糖片球菌保藏編號為CGMCC No.15074;食竇魏斯氏菌保藏編號為CGMCC No.15075;植物乳桿菌保藏編號為CGMCC No.15073，均保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗采用單因素設計，8個處理，分別為:1)PP04;2)WC10;3)LP694;4)M-1(PP04∶WC10=2∶1);5)M-2(PP04∶LP694=1∶2);6)M-3(WC10∶LP694=2∶1);7)M-4(PP04∶WC10∶LP694=2∶1∶1);8)CK(對照，無乳酸菌添加)。于2017年8月20日‘雅安’扁穗牛鞭草拔節期時刈割，將其切割成2～3 cm，在陰涼處凋萎至干物質含量為30%時再進行上述處理。用滅菌蒸餾水將每種乳酸菌添加劑稀釋至1.0×106CFU·g-1FW(CFU，colony-forming units;FW，fresh weight)，并用噴壺分別噴灑在原料上，混合均勻，以等體積無菌蒸餾水作為對照。每種處理重復3次，每個重復300 g。將混合后的樣品裝入尼龍-聚乙烯袋(25 cm×35 cm;奧居德，中國)，并用真空密封器(Evox-30，Orved，意大利)抽真空密封，在室溫(15～30℃)中發酵60 d。

1.2.2 青貯發酵品質及營養成分分析 開袋后，先利用德國農業協會(Deutche Landwirtschafts Gesellschaft，DLG)方法[14]評估不同處理下扁穗牛鞭草青貯飼料的感官品質。每種處理取20 g樣品加入180 m L蒸餾水在小型榨汁機中攪拌1 min，然后用8層紗布過濾，濾液用于測定各處理的p H值、乳酸含量、乙酸含量、丙酸含量、丁酸和氨態氮含量。將殺青后的新鮮原料和青貯飼料放到60℃的烘箱中干燥72 h，測定其干物質含量，通過計算青貯后與青貯前干物質含量的比值來確定干物質回收率。用研磨機粉碎青貯前后樣品，過0.425 mm篩，用于測定粗蛋白(crude protein，CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)，而相對飼用價值由公式[(88.9-0.779×ADF)×(120/NDF)]/1.29計算所得。

有機酸采用安捷倫-1260高效液相色譜儀(HPLC)(Shimadzu Co.Ltd.，Kyoto，Japan)分析，檢測器為SPD-10A VP，波長為210 nm。NH3-N含量依據Broderick等[15]的方法分析。粗蛋白和可溶性碳水化合物分別用凱氏定氮法和硫酸蒽酮比色法測定[16]，聚酯濾袋法測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維[17]。

1.2.3 微生物種群數量測定 青貯前后扁穗牛鞭草上微生物數量通過以下方法測定:稱取20 g樣品于180 m L無菌生理鹽水(0.85%NaCl)中完全浸沒，并在4℃下振蕩1 h。用該溶液制備系列梯度稀釋液(100～10-7)，并涂布于MRS瓊脂培養基(Difco，陸橋，中國北京，主要成分為蛋白胨、牛肉粉、酵母粉和葡萄糖等)，于37℃下厭氧(用封口膜密封培養皿)培養48 h后統計乳酸菌的菌落數。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Difco，陸橋，中國北京，主要成分為馬鈴薯浸粉、葡萄糖和瓊脂)上涂布稀釋液，于25℃下有氧培養4 d，用于酵母和霉菌計數。在結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基(Difco，陸橋，中國北京，主要成分為蛋白胨、乳糖、酵母粉和氯化鈉等)上涂布稀釋液，于37℃下有氧培養24 h，用于腸桿菌計數。

1.3 數據統計分析

用Excel表格和SPSS 19軟件對試驗數據進行方差分析和多重比較，試驗結果以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 青貯前‘雅安’扁穗牛鞭草的營養成分

青貯前‘雅安’扁穗牛鞭草營養成分如表1所示，干物質、粗蛋白、可溶性碳水化合物、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別為30.47%FW、13.26%DM、7.02%DM、62.68%DM和28.91%DM。

2.2 扁穗牛鞭草青貯前后的微生物計數

由表2可知，扁穗牛鞭草青貯后各處理的乳酸菌數量顯著高于青貯前(P＜0.05)。青貯前扁穗牛鞭草原料中乳酸菌數量最少，僅為2.23 log10CFU·g-1;青貯后，PP04、LP694、M-1和M-4處理組乳酸菌數量顯著高于其他處理組(P＜0.05)，最高的乳酸菌數量出現在LP694處理組中，為6.48 log10CFU·g-1。此外，PP04、M-2、M-3和M-4處理組沒有檢測到酵母菌，而對照組在青貯后酵母菌數量反而多于青貯前。腸桿菌只有在青貯前有檢測到，青貯后各處理均無腸桿菌，且青貯前后都無霉菌。綜上，青貯后，M-4處理組無酵母菌、腸桿菌和霉菌，乳酸菌數量較多，其微生物菌群最優。

表1 青貯前‘雅安’扁穗牛鞭草營養成分Table 1 Nutritional components of H.compressa cv.Ya’an before ensiling

表2 扁穗牛鞭草青貯前后的微生物計數Table 2 The microbial counts of H.compressa before and after ensiling(log10 CFU·g-1)

2.3 不同乳酸菌添加劑處理對扁穗牛鞭草感官品質的影響

由表3可知，添加了乳酸菌的牛鞭草青貯飼料無丁酸臭味或微弱丁酸臭味，莖葉結構保持較好，感官品質等級都高于沒有添加乳酸菌的對照處理。單個乳酸菌的處理組中，LP694處理組為1級優良，其感官品質優于PP04和WC10處理組。M-2、M-3和M-4處理組為1級優良，M-1為2級尚好，即2或3種乳酸菌混合添加的處理組的感官品質等級高于單個乳酸菌添加和無乳酸菌添加的對照組。

2.4 不同乳酸菌添加劑處理對扁穗牛鞭草發酵品質影響

由表4可知，添加乳酸菌處理組的發酵品質顯著優于對照組(P＜0.05)。處理組的p H值均低于4.2，其中，M-4處理組的p H值最低，為3.86;而對照組的p H值顯著高于處理組(P＜0.05)，為4.79。處理組的NH3-N/TN百分比顯著低于對照組(P＜0.05)，而添加乳酸菌的不同處理組間的NH3-N/TN百分比沒有顯著差異(P＞0.05)。其中，M-4處理組的乳酸含量最高，為72.32 mg·g-1DM;對照組的乳酸含量最低(P＜0.05)，為16.45 mg·g-1DM。處理組的乙酸和丁酸都低于對照組，此外，在本研究中沒有檢測到丙酸。單獨添加乳酸菌或者混合添加的不同處理間乙酸含量無顯著差異(P＞0.05)，其中單獨添加的WC10處理組乙酸含量最高，為1.39 mg·g-1DM，但均低于對照組乙酸含量。此外，LP694和復合添加乳酸菌處理組丁酸含量顯著低于其他處理組和對照組(P＜0.05)，均未超過7 mg·g-1DM，其中，M-2處理的丁酸含量最低，為4.65 mg·g-1DM。

2.5 不同乳酸菌添加劑處理對扁穗牛鞭草營養成分的影響

由表5可知，青貯后添加乳酸菌處理組的營養品質高于沒有添加乳酸菌的對照組。青貯后，各處理間干物質含量差異較小，最低的干物質含量出現在對照組中，為28.18%。就干物質回收率而言，處理組顯著高于對照組(P＜0.05)。青貯后各處理組的粗蛋白含量較青貯前變化較小，同樣，各處理組間粗蛋白含量差異也較小，其中，PP04處理組的粗蛋白含量最低(P＜0.05)，也略低于青貯前扁穗牛鞭草原料的粗蛋白含量。青貯后，各處理組可溶性碳水化合物含量較青貯前(7.02%DM)均降低，最低的可溶性碳水化合物含量出現在PP04和WC10處理組，為3.76%DM。各處理組間的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量無顯著差異(P＞0.05)，處理組青貯后的相對飼用價值高于對照組。

表3 不同添加劑處理對扁穗牛鞭草感官品質的影響Table 3 Effects of different additive treatments on the sensory quality of H.compressa

表4 不同添加劑處理對扁穗牛鞭草發酵品質的影響Table 4 Effects of different additive treatments on the fermentation quality of H.compressa

表5 不同添加劑處理對扁穗牛鞭草營養成分的影響Table 5 Effects of different additive treatments on the nutritional components of H.compressa

3 討論

3.1 乳酸菌添加劑對扁穗牛鞭草青貯前后微生物數量和感官品質的影響

牧草表面自然附著的乳酸菌數量會影響青貯料最終的發酵品質。當牧草表面附著的乳酸菌數量過低時，乳酸菌將無法形成優勢菌群，最終導致青貯飼料發酵品質和營養價值降低[18]。通過添加乳酸菌可使得牧草青貯時乳酸菌的數量增加，利于加快青貯發酵進程，抑制有害菌的生長，減少養分損耗，從而得到優質的牧草青貯飼料[19]。本研究中，青貯前原料中乳酸菌數量很少，僅為2.23 log10CFU·g-1;青貯后，PP04、LP694、M-1和M-4乳酸菌數量顯著增加，最高的乳酸菌數量出現在LP694處理組中，為6.48 log10CFU·g-1，這表明添加的乳酸菌在青貯中大量繁殖，但不同類型，不同配比乳酸菌在牛鞭草青貯中增殖程度不一致，一般同型發酵乳酸菌在青貯中繁殖程度高于異型發酵乳酸菌[11]，此外，M-4處理組中沒有檢測到酵母菌、腸桿菌和霉菌，乳酸菌的數量也高于對照組，參照Mcdonald等[20]優質青貯的標準，M-4組微生物組成最符合優質青貯的標準。該結果與M-4處理組的感官品質等級高于單一乳酸菌添加處理組和無乳酸菌添加的對照組相呼應。

添加乳酸菌處理組的感官品質等級高于對照組，可能是由于添加的乳酸菌能夠大量產生乳酸，降低p H值，減緩和防止青貯過程中飼料腐敗變質，而對照組因為原料所含酵母菌和腸桿菌較多，乳酸菌少，青貯前期有害菌繁殖較快，消耗了飼草的營養物質[21]，產生大量的丁酸，使青貯飼料芳香味變弱，具有酸臭味。但由于感官品質的評價主觀性較強，所述結果還需要進一步分析與驗證。

3.2 乳酸菌添加劑處理對扁穗牛鞭草青貯發酵品質的影響

一般認為p H值小于4.2時，青貯中的有害菌才能受到抑制，進而保證青貯飼料具有良好的發酵品質[22]。本試驗中，添加單一或復合乳酸菌處理組的p H值都小于4.2，其中，M-4處理組的p H值最低(3.86)，這表明實驗室前期篩選出的3株乳酸菌無論是單一添加還是復合添加，均能有效降低牛鞭草青貯p H值，與舒思敏等[3]的研究結果一致。本研究中，添加乳酸菌處理組的乳酸含量均高于對照組，表明添加乳酸菌使得青貯中乳酸菌數量大量增加，從而提高了其代謝產物乳酸的含量[17]。在牧草青貯過程中，當干物質為25%～35%時乳酸含量應為6%～10%DM[23]，因此本研究中LP694和M-4處理組的乳酸含量符合優質青貯標準。NH3-N/TN能反映出青貯飼料中蛋白質和氨基酸的分解程度[24]，NH3-N/TN越小，說明分解程度越低。侯建建等[25]將乳酸菌添加到苜蓿(Medicago sativa)中青貯，結果表明添加高濃度(7 log10CFU·g-1)的單一植物乳桿菌處理的苜蓿青貯發酵品質最好，而植物乳桿菌與干酪乳桿菌的復合菌能保護更多的真蛋白不被降解。在本研究中，添加戊糖片球菌、食竇魏斯氏菌和植物乳桿菌復合菌的M-4處理組的發酵品質最好，蛋白質和氨基酸的分解程度最低，說明3種乳酸菌的配比能有效抑制真蛋白的降解，其原因一方面可能是添加M-4后，乳酸菌大量繁殖，進而抑制了霉菌、腸桿菌等有害微生物的生長繁殖，降低了有害微生物對青貯料中蛋白質和氨基酸的分解利用;另一方面，較低的p H抑制了植物蛋白酶的活性，降低了青貯料自身對蛋白質和氨基酸的損耗[26-27]。

此外，同型發酵乳酸菌在青貯發酵時只產生乳酸，而異型發酵乳酸菌不僅能產生乳酸，還產生乙酸等有助提高青貯飼料的有氧穩定性的有機酸，對減緩或防止青貯飼料二次發酵有明顯作用[19，28]。本試驗中，添加異型發酵乳酸菌(WC10)處理組乙酸含量略高于添加同型發酵乳酸菌(PP04或PL694)處理組，無顯著差異，但均低于對照，這可能是由于牛鞭草原料上本身就附著較多的異型發酵乳酸菌，導致對照組青貯過程中產生了更多的乙酸[29]，與此同時，乳酸產生不足同樣導致對照組p H無法降低至4.2以下。3種乳酸菌復合添加的M-4處理組的乳酸含量高于2種乳酸菌復合添加處理組和單一乳酸菌處理組，這表明不同發酵類型的乳酸菌按不同的方式混合添加，其協同作用各不相同[14，30]，但菌株之間是如何協同作用還需要更多研究證實。

3.3 乳酸菌添加劑處理對扁穗牛鞭草營養品質的影響

處理組的干物質含量和干物質回收率都高于對照組，可能是由于添加乳酸菌后，增加了乳酸菌含量，產酸速率快，能快速降低p H值抑制有害微生物的繁殖，降低牧草干物質的損耗[31]。青貯后的粗蛋白和可溶性碳水化合物含量均下降，除LP694處理組外，其余添加乳酸菌處理組的WSC含量均低于對照組，可能是添加的乳酸菌利用WSC進行生長繁殖產生大量的乳酸，造成青貯后WSC含量下降[32-33]。各處理組間的NDF和ADF無顯著差異，該變化與在苜蓿和玉米青貯中的發現相似，其含量均不受乳酸菌添加劑的影響[34-35]。添加乳酸菌的處理組的相對飼用價值高于對照組，說明添加乳酸菌能夠平衡青貯飼料的營養品質，提高其飼用價值，有利于畜牧的生產和發展。

4 結論

無論是單一添加還是復合添加戊糖片球菌(PP04)、食竇魏斯氏菌(WC10)和植物乳桿菌(LP694)均有利于改善牛鞭草青貯發酵品質和營養成分，但同型發酵乳酸菌(PP04或LP694)單獨添加于牛鞭草青貯中效果好于異型發酵乳酸菌(WC10)單獨添加。乳酸菌兩兩復合添加的青貯效果各異，但均不如3種乳酸菌按比例復合添加。綜上所述，戊糖片球菌PP04∶食竇魏斯氏菌WC10∶植物乳桿菌LP694=2∶1∶1復合的處理M-4添加于牛鞭草青貯中效果最佳，具有推廣利用的潛質，在生產實踐上可深入研究。