CP-25通過調控T細胞亞群治療大鼠膠原性關節炎

湯小雨，王 琛，韓 樂，張賢政，疏金玲，蔡小雨，朱 悅，張玲玲，魏 偉

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性、系統性、自身免疫性疾病，其主要病理表現在于關節滑膜炎。RA在全球都有分布，骨和軟骨破壞是導致患者工作能力喪失和殘疾的主要原因之一[1]。RA的主要病理特征包括滑膜細胞增生、內襯層的增厚、多種炎性細胞浸潤，軟骨和骨組織的破壞，并最終導致關節畸形和功能喪失。雖然有關細胞因子和其他炎癥介質在RA發病中的作用做了大量研究，但RA的發病機制尚不明確[2]。異常活化的T細胞在RA病理機制中起關鍵作用，同時分化的T細胞亞群在RA中也存在失衡。其中，Th17細胞分泌高水平的IL-17，加速RA的發生發展[3]。膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis, CIA)是一種免疫炎性動物模型，因為該模型有許多組織學和免疫學特征與RA相似，所以是篩選和研究治療RA的藥物的比較理想的動物模型[4]。

芍藥苷-6-氧-苯磺酸(paeoniflorin-6'-O-benzenesulfonate, CP-25)是衍生的新型芍藥苷活性單體。課題組前期研究[5-6]顯示CP-25能夠通過調節免疫應答而抑制大鼠佐劑性關節炎、小鼠CIA的繼發炎癥。艾拉莫德是具有免疫調節活性的環氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)抑制藥，臨床用于治療成人活動性RA[7]。艾拉莫德對大鼠CIA有明顯的抗炎作用及關節滑膜保護作用，其機制可能與下調致炎因子白細胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平有關[8]。該研究擬在通過建立大鼠CIA模型的基礎上，觀察CP-25對大鼠CIA的治療作用以及對活化T細胞亞群和分化T細胞亞群的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 40只雄性Wistar大鼠購于上海斯萊克公司，(150±20)g，42 d齡，合格證號：2015000532883。大鼠均在標準實驗室條件下飼養。本研究所采用的實驗方案均遵循實驗室動物倫理準則，且經過安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理審查委員會批準。

1.1.2藥物和試劑 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)通道小鼠抗-兔CD3、別藻青蛋白(allocyanin, APC)通道小鼠抗-兔CD4、藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)通道小鼠抗-兔 CD25、PE小鼠抗-兔 IFN-γ、PE 小鼠抗-兔 IL-4購自美國Becton, Dickinson(BD) 抗體公司；抗-小鼠/兔 IL-17A PE、FITC抗-小鼠/兔轉錄因子蛋白3(forkhead box protein 3, Foxp3)購自美國eBioscience公司；雞II型膠原(CII)購自美國康德瑞公司；PBS：KCl 0.2 g，NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 1.82 g和KH2PO40.2 g溶于雙蒸水800 ml，將溶液的pH值調節至7.4，高壓蒸汽滅菌，儲存在4 ℃下以備使用；艾拉莫德(iguratimod)：江蘇先聲藥業有限公司國家藥品標準H20110084(25 mg，14粒/盒)；CP-25：由安徽醫科大學臨床藥理研究所制藥部門提供，白色粉末，純度大于98%。

1.2 主要儀器AA-200DS電子天平購自美國Denver Instrument公司；Bio Tek Elx×808 酶標儀購自美國Bio Tek公司，BX-50型正置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；FC500流式細胞儀、FACScan儀器購自美國貝克曼庫爾特公司；GL20A全自動高速冷凍離心機購自中國湖南儀器儀表總廠離心機廠；JA2003A型電子分析天平購自中國上海精天電子儀器廠；KDC-40超速離心機購自中國安徽科大創新中佳公司；Sim-F140制冰機購自日本SANYO公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺購自江蘇蘇州蘇凈集團安泰公司，YLS-7B足趾容積測量儀購自中國山東醫學科學院；高壓蒸汽滅菌鍋購自中國臺灣STURDY公司。

1.3 實驗方法

1.3.1大 鼠CIA模型的制備 在操作臺中，將雞Ⅱ型膠原溶于 0.05 mol/L的冰醋酸中，并在4 ℃下攪拌至完全溶解，終濃度為 4 mg/ml，置 4 ℃ 冰箱過夜，再將卡介苗(濃度為8 mg/ml)與其等體積混合使之充分乳化以制備雞II型膠原乳液(所有操作都需要避光并且無菌)。第0天(第1次免疫日)于每只大鼠尾根部、足趾部多點(3～4點)皮內注射 0.2 ml CⅡ乳劑。第7天在尾根部、背部多點皮內注射0.1 ml的該乳劑作為加強[9]。

1.3.2實驗分組和給藥情況 Wistar系雄性大鼠按體質量隨機分為4組：正常組、模型組、CP-25組和艾拉莫德組，每組10只。除正常組外，另外三組大鼠均制備CIA模型。大鼠建立CIA模型，第2次激發誘導后，當大鼠足爪出現紅腫即開始給藥。CP-25組大鼠每天1次灌胃給予CP-25，劑量為每只大鼠50 mg/kg，艾拉莫德組大鼠每天1次灌胃給予艾拉莫德，劑量為每只大鼠10 mg/kg，兩種藥均持續給藥7周。正常組和模型組大鼠用相同體積生理鹽水灌胃。

1.3.3足趾容積測量和關節炎足爪腫脹數評分 大鼠建立CIA模型后，每隔3 d對CIA大鼠進行1次足趾容積測量。炎癥出現后，每隔3 d對CIA大鼠進行1次關節炎足爪腫脹數評分。按 0～4五級評分：每只足爪計1個踝關節和5個趾關節，每個關節腫脹為1分，每只鼠累計最多關節腫脹數24分。

1.3.4CIA大鼠脾臟的病理學觀察 處死大鼠后，將脾臟無菌剝離并用HE染色。顯微鏡下觀察不同組大鼠的組織病理學變化。根據動脈周圍淋巴鞘的細胞密度，淋巴結節(淋巴濾泡)增生，紅髓充血和生發中心的數量確定脾臟病理學，具體評分標準如表1所示[10]。

1.3.5CIA大鼠踝關節的病理學觀察 先用10%甲醛溶液將大鼠踝關節固定后脫鈣脫水，用石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察不同組大鼠踝關節的組織病理形態，根據滑膜細胞增殖、細胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨侵蝕的狀況來確定脾臟病理學，具體評分標準如表2所示[11]。

1.3.6胸腺指數和脾指數的測定 第56天處死大鼠，在無菌環境中取脾臟和胸腺并分別稱重。分別用每只大鼠“胸腺或脾臟的質量”比上相應“大鼠的質量”，即得到胸腺指數或脾臟指數。

1.3.7T、B淋巴細胞的分離 處死大鼠后，無菌剝離胸腺和脾臟。先常規制備胸腺細胞懸液和脾臟細胞懸液，再經大鼠淋巴細胞分離液純化，從胸腺中分離出T淋巴細胞，從脾臟中分離出B淋巴細胞，調節細胞濃度至1×106個/ml。

1.3.8ConA誘導的胸腺T淋巴細胞增殖反應 將1.3.7得到的胸腺T細胞以每孔約1×105個細胞接種于96孔板中。加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640，最終體積為200 μl，每個具有3個重復孔。加入ConA后置5%CO2培養箱中于37 ℃孵育48 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1～4 h，然后取出96孔板，將其置于酶-連接免疫吸附檢測器，搖動15 s，然后在450 nm測量吸光度并對結果進行統計學分析。

表1 CIA大鼠脾臟病理的評分標準(n=10)

表2 CIA大鼠踝關節病理的評分標準

1.3.9LPS誘導的脾臟B淋巴細胞增殖反應 將1.3.7得到的脾臟B細胞以每孔約1×105個細胞接種于96孔板中。加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640，最終體積為200 μl，每個具有3個重復孔。加入LPS后置在5%CO2培養箱中于37 ℃孵育48 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1～4 h，然后取出96孔板，將其置于酶-連接免疫吸附檢測器，搖動15 s，然后在450 nm測量吸光度并對結果進行統計學分析。

1.3.10流式細胞術檢測大鼠外周血T細胞比例及脾臟T細胞亞群的表達 通過尾部血液取樣獲得大鼠外周血，并用紅細胞裂解物分離淋巴細胞。根據說明書中推薦的濃度比，將CD3(FITC通道)、CD4(APC通道)和CD25(PE通道)的抗體組合分別添加到圓底管中。在室溫下避光孵育后，洗滌細胞并通過流式細胞術分析。用FACScan儀器和相關的CellQuest軟件分析細胞相關的熒光。第56天處死大鼠取脾臟，用紅細胞裂解液分離脾臟淋巴細胞，然后將淋巴細胞懸浮液轉移到圓底管中。將CD4(APC通道)、IL-17A(PE通道)、IFN-γ(PE通道)、IL-4(PE通道)的抗體組合按照說明書建議的濃度比例分別添加到圓底管中。① 細胞需要提前加4 μl細胞刺激劑，于5%CO2、37 ℃培養箱孵育6～8 h；② 6～8 h后取出細胞轉移至微量離心管(EP管)中離心(2 500 r/min，10 min)后，棄上清液，用PBS洗滌1次，再離心；③ 在避光室溫下添加表面抗體CD4(APC通道)孵育20 min；④ 每孔添加80 μl固定劑，振蕩，在室溫下避光孵育10 min，搖晃；⑤ 洗滌通過離心，每孔添加80 μl打孔劑，在室溫下避光孵育8 min；加胞內抗體IL-17A(PE通道)避光孵育20 min(不可振蕩)。在室溫黑暗中孵育后，洗滌細胞并通過流式細胞術分析。Th1細胞、Th2細胞的檢測同上。

2 結果

2.1 CIA大鼠的腫脹情況及藥物的影響第1次造模作為第0天，7 d后加強給藥，第12天大鼠足爪出現紅腫，首先是原發側紅腫，以后延伸到繼發側、尾部、耳部。從第12天給予CP-25、艾拉莫德治療。同時開始每周進行兩次足趾容積測量、足爪腫脹數計數。肉眼觀察顯示，第21～31天為腫脹高峰期，第38天后腫脹逐漸減輕。CP-25、艾拉莫德明顯降低CIA大鼠足爪腫脹(圖1A)。與正常組比較，CIA模型組足趾容積、足爪腫脹數評分明顯升高 (P<0.05)。與模型組比較，CP-25、艾拉莫德能夠減輕大鼠CIA的足趾容積、足爪腫脹數(P<0.05)。模型組、CP-25組、艾拉莫德組足趾容積、足爪腫脹數評分在第21～31天達到高峰值隨后逐漸下降(P<0.05)。其中CP-25組大鼠CIA的足爪腫脹數從第32天逐漸下降。艾拉莫德組大鼠足爪腫脹數從第30天逐漸下降(圖 1B、1C)。

2.2 CIA大鼠脾臟病理變化情況及CP-25的影響將脾臟病理從以下四個方面進行分析：生發中心，淋巴鞘，淋巴濾泡，紅髓。數據統計結果見表3。結果發現，與正常組比較，光鏡下CIA模型組大鼠脾臟白髓淋巴組織明顯增生，淋巴鞘細胞密度增加，生發中心出現(P<0.05)；與模型組比較，CP-25組白髓淋巴組織增生明顯減輕，生發中心和淋巴濾泡增生明顯減輕，淋巴鞘細胞密度增加也顯著減弱(P<0.05)(圖2)。

2.3 CIA大鼠踝關節病理學的檢查通過以下四個方面對足關節病理進行分析：滑膜細胞增生，細胞侵蝕，血管翳，炎癥，骨侵蝕。數據統計分析結果見表4。結果發現，與正常組比較，光鏡下可見CIA模型組大鼠的滑膜組織中滑膜細胞增生明顯，層次增多，排列紊亂，滑膜下層纖維組織增生，炎性細胞浸潤及血管翳形成，軟骨中炎性細胞浸潤，軟骨組織破壞(P<0.05)；與模型組比較，CP-25組和艾拉莫德組不同程度改善以上病理變化，滑膜細胞層未見明顯增多，炎性細胞浸潤減少；明顯改善滑膜下層炎性細胞浸潤和滑膜血管充血(P<0.05)(圖3)。

2.4 CP-25降低CIA大鼠胸腺指數、脾臟指數及抑制T、B淋巴細胞增殖反應4組大鼠胸腺指數的測量結果見表5。與正常組比較，CIA模型組大鼠的胸腺指數明顯升高(P<0.05)。與CIA模型組比較，CP-25組、艾拉莫德組明顯降低胸腺指數和脾臟指數(P<0.05)(圖 4A)。統計四組大鼠胸腺增殖指數和脾臟增殖指數的結果，見表6。與正常組比較，CIA模型組大鼠的T、B淋巴細胞增殖能力明顯增加(P<0.05)。與CIA模型組比較，CP-25組、艾拉莫德組CIA大鼠的T、B淋巴細胞的增殖明顯被抑制(P<0.05)(圖 4B)。

圖1 CP-25對CIA大鼠足爪腫脹的影響及對足趾容積、足爪腫脹數的影響

A：CP-25對CIA大鼠足爪腫脹的影響；a：正常組；b：模型組；c：CP-25組；d：艾拉莫德組；B：CP-25對CIA大鼠足趾容積的影響；C：CP-25對大鼠足爪腫脹數的影響；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；CP-25組與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；艾拉莫德組與模型組比較：▽P<0.05，▽▽P<0.01

圖2 CP-25對大鼠脾臟病理變化的影響

A：各組大鼠脾臟的病理圖×10；a：正常組：↑顯示紅髓，↓顯示白髓；b：模型組：→出現生發中心，←顯示淋巴濾泡增生；c：CP-25組；d：艾拉莫德組；B：CP-25對CIA大鼠脾臟病理的影響的統計分析；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 CP-25對大鼠踝關節病理變化的影響

A：各組大鼠踝關節的病理圖×10；a：正常組：↓呈單層滑膜；b：模型組：↓顯示炎性細胞浸潤，←顯示血管翳，→顯示軟骨破壞；c：CP-25組；d：艾拉莫德組；B：CP-25對CIA大鼠踝關節病理的影響的統計分析；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

表3 CP-25對CIA大鼠脾臟病理的影響

表4 CP-25對CIA大鼠踝關節病理的影響

表5 CP-25對CIA大鼠胸腺、脾臟指數的影響

表6 CP-25對CIA大鼠胸腺、脾臟增殖指數的影響

表7 CP-25對CIA大鼠外周血各細胞亞群變化的影響

圖4 CP-25對大鼠胸腺、脾臟指數及T、B細胞增殖指數的影響

A： CP-25對大鼠胸腺、脾臟指數的影響；B：CP-25對大鼠胸腺T細胞、脾臟B細胞增殖指數的影響；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與正常組相比：#P<0.05，##P<0.01

圖5 CP-25對CIA大鼠外周血各T細胞所占比例的影響及統計分析

A：CP-25對CIA大鼠外周血各細胞所占比例的影響的流式圖；B：CP-25對CIA大鼠外周血各細胞所占比例的統計分析；與正常組比較：##P<0.01；與模型組比較：**P<0.01

2.5 CIA大鼠外周血活化T細胞亞群變化及CP-25對其影響將細胞流式術分析測得的CIA大鼠外周血中各細胞百分比的結果進行統計，見表7。與正常組比較， CIA模型組中大鼠外周血CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD4+CD25+T細胞所占比例顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，CP-25組中CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD4+CD25+T細胞的比例明顯降低(P<0.05)(圖 5)。

2.6 CIA大鼠脾臟分化T細胞亞群變化及CP-25對其影響通過統計流式細胞術檢測各組大鼠脾臟分化T細胞亞群脾臟CD4+IFN-γ+Th1細胞，CD4+IL-4+Th2細胞，CD4+IL-17A+Th17細胞的百分比，見表8。結果發現，與正常組比較，CIA模型組中大鼠脾臟中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-4+Th2的比例顯著升高，CD4+IL-17A+Th17細胞的比例顯著升高，P<0.05；與模型組比較，CP-25顯著降低大鼠脾臟中CD4+IFN-γ+Th1細胞，CD4+IL-4+Th2細胞的表達比例，明顯減少大鼠脾臟中CD4+IL-17A+Th17細胞的百分含量(P<0.05)(圖6)。

表8 CP-25對CIA大鼠脾臟各細胞亞群變化的影響

圖6 CP-25對CIA大鼠脾臟Th1、Th2、Th7細胞亞群變化的影響及統計分析

A:CP-25對CIA大鼠脾臟中各細胞在脾臟中百分含量的影響的流式圖；B：CP-25對CIA大鼠脾臟中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-4+Th2、CD4+IL-17A+Th17細胞在脾臟中百分含量的影響的統計分析；與正常組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

芍藥是一種中藥，具有抗炎、解痙和止痛作用。白芍(total glucosides of paeony, TGP)是從芍藥的根部中提取，并批準了1998年芍藥苷(Paeoniflorin, Pae)治療RA。Pae是TGP的有效天然活性成分。TGP和Pae具有抗炎和免疫調節作用[12]。為了提高Pae的生物利用度，本實驗室通過對Pae的化學結構進行修飾獲得了CP-25[3]。

CIA模型的臨床表現為多發性外周關節炎，病理變化主要是增殖性滑膜炎、關節軟骨的破壞、骨侵蝕、在關節腔內有明顯炎性細胞浸潤等；有高濃度 IgG抗體自體II型膠原存在于動物體內[13]。由于其病理過程及實驗室指標與RA相似，是篩選和研究治療RA藥物的較理想模型[14]。本研究中，肉眼觀察到CP-25能夠減輕CIA大鼠的腫脹情況，降低CIA大鼠的足趾容積、減少CIA大鼠的足爪腫脹數。光鏡下觀察到CP-25可以明顯改善CIA大鼠脾臟病理情況，減輕白髓淋巴組織增生，減少生發中心個數和緩解濾泡增生，淋巴鞘細胞密度的增加也被顯著減弱；CP-25可以不同程度改善CIA大鼠踝關節病理情況，CP-25組大鼠滑膜細胞層正常，細胞浸潤減少，滑膜下層炎性細胞浸潤和滑膜血管充血被明顯改善。該研究結果提示CP-25對大鼠CIA繼發炎癥具有明顯抗炎作用。

RA是一種自身免疫性疾病，T和B淋巴細胞的參與該病的發生和發展。效應T細胞可以分為Th1細胞(CD4+IFN-γ+)、Th2細胞(CD4+IL-4+)和Th17細胞(CD4+，IL-17A+)。其中，Th1細胞主要產生IFN-γ和IL-2，并在細胞免疫介導的炎癥反應中起促進作用；Th2細胞主要生產IL-4、IL-5和IL-13，它可以促進B淋巴細胞的增殖和分化，并促進抗體產生和體液免疫；Th17細胞分泌的IL-17能夠促進破骨細胞活化及基質金屬蛋白酶的合成，誘導關節軟骨降解[15]。因此T、B淋巴細胞間相互作用在RA的發病機制中有著非常重要的意義。本研究結果顯示CP-25可以抑制CIA大鼠體內T、B淋巴細胞增殖反應，提示CP-25對CIA大鼠的治療作用與T、B淋巴細胞有一定關系。CP-25可以降低CD4+IL-17A+Th17細胞的表達；CP-25可以降低CD4+IFN-γ+Th1細胞、CD4+IL-4+Th2細胞的表達。因此，CP-25可能通過影響效應T細胞(CD4+T細胞)之間的平衡來調控大鼠CIA的異常免疫應答和炎癥反應。

綜上所述，CP-25對大鼠CIA有明顯治療作用，可以有效緩解CIA大鼠的足趾容積增加、腫脹數增加，改善脾臟、踝關節病理變化，在CIA的發病過程中，CP-25具有良好的抗炎免疫軟調節活性，可能通過多種途徑調節CIA大鼠體內異常的免疫反應，這一研究提示CP-25在臨床治療RA有潛在前景。